Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

 
4.1. Конструирование и применение ГМ-микроорганизмов 
 
Методами генетической инженерии удается усилить полезные для 
самых разных сфер народного хозяйства свойства микроорганизмов, а 
также сконструировать новые формы, не существующие в окружаю-
щей среде. Это очень важное условие применения микроорганизмов в 
промышленности, поскольку производства, основанные на использо-
вании микроорганизмов, оказываются рентабельными лишь при усло-
вии применения высокопродуктивных штаммов-продуцентов. Кроме 
высокой продуктивности микроорганизмы должны обладать и други-
ми полезными свойствами, обеспечивающими ведение технологиче-
ского процесса. Сюда относятся скорость роста, устойчивость к по-
вышенной температуре и кислотности среды, фагоустойчивость, ста-
бильность наследования признаков, способность усваивать дешевые и 
доступные субстраты и др. 
Рассмотрим отдельные сферы применения усовершенствованных 
микроорганизмов в народном хозяйстве. 
Получение с помощью микроорганизмов низкомолекулярных 
коммерческих продуктов. 
Производство аминокислот. Аминокислоты (АК) широко при-
меняются в пищевой промышленности как усилители вкуса и аромата 
(аланин, аспартат, глутамат), как пищевые добавки и антиоксиданты; 
в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок; в медицине для 
терапии послеоперационных больных, при лечении язв, бронхитов и 
др.; в химической промышленности в качестве исходных веществ при 
синтезе полимеров и производстве косметических средств. 
Ежегодно в мире производится более 800 000 т аминокислот, 
большую часть которых составляет L-глутаминовая кислота, которая 
используется для получения широко известного усилителя вкуса и 
аромата – глутамата натрия. 
Стоит отметить, что лидирующие позиции в получении высоко-
продуктивных штаммов бактерий, синтезирующих избыточные коли-
чества аминокислот, долгое время принадлежали российской школе 
генетиков, возглавляемой вначале Сосом Исааковичем Алиханяном, а 
позже – Вадимом Георгиевичем Дебабовым. Эти работы начаты во 
ВНИИ Генетика в 60-е гг. ХХ в., а в 80-е гг. получены патенты на про-

---

147 
дуценты треонина, которые были проданы в Японию – страну, где 
впервые стали получать АК методом микробной ферментации. Ко-
нечно, поначалу селекционная работа с бактериями целиком основы-
валась на классических методах – индуцированном мутагенезе in vivo 
и последовательном насыщении генома бактерий определенными му-
тациями. Стоит остановиться на этих достижениях более подробно. 
Первыми объектами для селекции служили бактерии Corynebacte-
rium и Brevibacterium spp. – неспорулирующие грамположительные 
почвенные бактерии, отличительной особенностью которых является 
природная способность продуцировать избыточные количества глу-
таминовой кислоты. Основным направлением работы с коринебакте-
риями являлось получение мутантов и совмещение мутаций в одной 
клетке. Основными типами мутаций являлись следующие: 
– регуляторные мутации, которые обеспечивают генетическую 
дерепрессию или десенсибилизацию ферментов биосинтетического 
пути. Их отбирают по признаку устойчивости к структурным анало-
гам АК, а иногда и среди ревертантов ауксотрофных мутантов. Ана-
логоустойчивость сопровождается также нарушением транспорта АК 
в клетку; 
– мутации по неспособности к образованию метаболита – ингиби-
тора синтеза нужной АК; 
– мутации, приводящие к блокированию синтеза метаболита, рас-
ходующего общий с нужной АК предшественник; 
– мутации по неспособности к дальнейшему метаболическому 
превращению АК (их отбирают по ауксотрофности). 
Стратегия традиционной селекции состояла в следующем: инду-
цировали мутации в геномах бактерий, отбирали перспективные му-
тантные бактерии, определяли биохимическую природу мутаций, сов-
мещали мутации в одной клетке, пользуясь системами генетического 
обмена. Необходимо подчеркнуть, что подобный подход позволил по-
лучить продуценты практически всех протеиногенных АК с уровнем 
продуктивности 15–100 г/л, что дало возможность организовать в 
бывшем СССР крупнотоннажное производство ряда АК (лизин, глу-
тамат, треонин и др.). 
В то же время в середине 70-х гг. накопились серьезные достиже-
ния молекулярной генетики и генетической инженерии, которые соз-
дали реальные предпосылки для замены традиционных методов и 
объектов селекции продуцентов АК методами конструирования 
штаммов. Объектом этих работ стала кишечная палочка как наиболее 
изученный на то время микроорганизм: для этой бактерии известны 

---

148 
молекулярные механизмы репликации ДНК, транскрипции и трансля-
ции, регуляции активности разных генов, лучше всего разработаны 
приемы генетического обмена и трансформации. Рассмотрим эти ме-
тоды на примере триумфального процесса получения продуцентов 
треонина во ВНИИГенетика.
У штамма дикого типа E. coli K 12 среди мутантов, устойчивых к 
аналогу треонина, был отобран штамм MG442, у которого продукция 
треонина (3 г/л на среде с 3% глюкозы) была обусловлена по меньшей 
мере тремя мутациями: 
1) thrA442, которая делает гомосериндегидрогеназу не чувстви-
тельной к ингибированию треонином; 
2) ilvA442 в гене ilvA, кодирующем треониндезаминазу – первый 
фермент на пути превращения треонина в изолейцин. Этот мутантный 
блок является неполным (leaky-мутация) и приводит к резкому сниже-
нию сродства треониндезаминазы к треонину. Мутация снижала пре-
вращение треонина в изолейцин и ослабляла мультивалентную ре-
прессию треонинового оперона; 
3) relA (реверсия), обеспечивающей восстановление строгого 
контроля синтеза РНК. 
Затем треониновый оперон из штамма MG442 был клонирован в 
составе мультикопийного вектора pBR322 и возвращен в родительский 
штамм MG442 (амплификация генов), в который предварительно с по-
мощью трансдукции ввели мутацию в гене thrС, сделав этот штамм 
ауксотрофным по треонину, и в гене ilvA (ауксотрофность по изолей-
цину). Это обеспечивало стабильное наследование плазмиды клетками 
на синтетической среде без треонина, а также супрессию ауксотрофно-
сти по изолейцину (за счет сверхпродукции теронина). Полученный 
штамм накапливал в культуральной жидкости (КЖ) до 20 г/л треонина, 
что почти в 2 раза лучше достижения того времени (1981 г.). 
В дальнейшем этот штамм был существенно усовершенствован: 
– отобран вариант со слизистым характером колоний с поврежде-
ниями в гене lon, что выражалось в стабилизации ферментов, обеспе-
чивающих сверхсинтез треонина; 
– получены мутации, активирующие процесс аммонирования (усво-
ения неорганического аммония); 
– с помощью конъюгации в него введены расположенные на плаз-
миде гены, контролирующие усвоение сахарозы и, следовательно, 
дешевого субстрата – мелассы. В дальнейшем было установлено, что 
детерминанты усвоения сахарозы расположены в транспозоне Tn2555, 
и была проведена его интеграция в хромосому реципиента; 

---

149 
– усовершенствованы условия ферментации, что привело к созда-
нию рекордного процесса биосинтеза L-треонина, при котором за 30–
40 ч ферментации накапливается до 70 г/л треонина с конверсией са-
хара в целевой продукт, превышающей 40%. 
Гомосерин является предшественником треонина и метионина. 
Это соединение находит применение в фармацевтической промыш-
ленности, а также в производстве лизина микробным синтезом, по-
скольку промышленные продуценты лизина – это штаммы коринебак-
терий, ауксотрофные по гомосерину. 
Для получения штамма – сверхпродуцента гомосерина требуется 
активная работа генов, кодирующих только аспартокиназу и гомосе-
риндегидрогеназу, а последующее превращение гомосерина в треонин 
должно быть блокировано. Поэтому гибридная плазмида, несущая 
весь треониновый оперон, была подвергнута интенсивному мутагене-
зу in vitro гидроксиламином. После трансформации штамма E. coli, 
несущего мутацию в гене thrB, были отобраны клетки, продуцирую-
щие гомосерин в большом количестве, – пример эффективности лока-
лизованного мутагенеза.