Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Гибридизация клеток животных. Наиболее перспективным на-
правлением клеточной инженерии в настоящее время является полу-
чение гибридом. Основная цель – «обессмертить» клетку, продуци-
рующую ценные вещества, путем слияния с раковой клеткой и клони-
рования полученной гибридомной линии.
Гибридома – это гибридная клеточная линия, полученная при 
слиянии нормальных и миеломных клеток. Обладает способностью к 
неограниченному росту и синтезу моноклональных антител. Миелом-
ная клетка – это клетка злокачественной опухоли иммунной системы. 
Гибридомы получены на основе клеток – представителей различ-
ных царств живого. Слияние клеток растений, обычно медленно рас-
тущих в культуре, с клетками растительных опухолей позволяет по-

---

142 
лучить клоны быстрорастущих клеток – продуцентов нужных соеди-
нений. Но наиболее многообразны и широко востребованы примене-
ния гибридомной технологии к животным клеткам, где с ее помощью 
получают неограниченно размножающиеся продуценты гормонов и 
белковых факторов крови. Наибольшее практическое значение имеют 
гибридомы – продукты слияния клеток злокачественных опухолей 
иммунной системы (миелом) с нормальными клетками той же систе-
мы – лимфоцитами. 
При попадании в организм животного или человека чужеродно-
го агента – бактерий, вирусов, «чужих» клеток или просто сложных 
органических соединений – лимфоциты мобилизуются для обезвре-
живания введенного агента. Имеется несколько популяций лимфо-
цитов, функции которых различаются. Существуют так называемые 
Т-лимфоциты, среди которых выделяются Т-киллеры («убийцы»), не-
посредственно атакующие чужеродный агент с целью его инактива-
ции, и В-лимфоциты, основная функция которых состоит в продукции 
иммунных белков (иммуноглобулинов), узнающих чужеродный агент. 
В-лимфоциты вырабатывают иммунные белки, представляющие со-
бой антитела к чужеродному агенту – антигену.
Ни Т-, ни В-лимфоциты не могут воспроизводиться в культуре. 
Однако слияние Т-лимфоцита-киллера с опухолевой клеткой дает 
клон неограниченно размножающихся клеток, выслеживающих опре-
деленный антиген – тот, к которому был специфичен взятый для гиб-
ридизации Т-лимфоцит. Подобные Т-киллерные гибридомные клоны 
используют в борьбе с раковыми клетками в организме больного. 
При слиянии В-лимфоцита с миеломной клеткой получаются 
В-гибридомные клоны, широко применяемые как продуценты анти-
тел, специфических к тому же антигену, что и антитела, синтезируе-
мые породившим клон В-лимфоцитом, т. е. моноклональных анти-
тел. Моноклональные антитела однородны по своим свойствам, они 
обладают одинаковым сродством к антигену и связываются с одной 
единственной антигенной детерминантой молекулы-мишени (эпито-
пом). В этом состоит важное преимущество моноклональных анти-
тел – продуктов В-гибридом перед антителами, получаемыми без при-
менения клеточной инженерии, путем иммунизации лабораторного 
животного избранным антигеном – поликлональными антителами. 
Поликлональные антитела выделяют из сыворотки крови иммунизи-
рованного животного или получают в результате непосредственного 
взаимодействия антигена с популяцией лимфоцитов в культуре ткани. 
В итоге получается смесь антител (поликлональный препарат), раз-

---

143 
личных по специфичности и сродству к одному и тому же антигену, 
что объясняется участием в выработке антител различных клонов
В-лимфоцитов и наличием у антигена нескольких эпитопов, каждый 
из которых соответствует особому типу антител. Основными недос-
татками поликлональных антител являются следующие: содержание 
отдельных антител в поликлональном препарате варьирует от одной 
партии к другой; их нельзя применять, если необходимо различить 
две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная 
(не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. На-
оборот, моноклональные антитела избирательно связываются лишь с 
одной антигенной детерминантой, что имеет большое практическое 
значение для распознавания и лечения заболеваний, вызываемых чу-
жеродными агентами – бактериями, грибами, вирусами, токсинами, 
аллергенами и собственными трансформированными (раковыми) 
клетками. Моноклональные антитела также успешно и широко при-
меняют в аналитических целях для изучения клеточных органелл и 
биомолекул, тестирования лекарственных препаратов, оценки и мони-
торинга разных онкологических заболеваний, идентификации и кон-
троля патогенных микроорганизмов, для иммунологического скри-
нинга продуктов генов. 
Общая схема получения гибридом на основе миеломных клеток и 
иммунных лимфоцитов включает следующие этапы. 
1. Получение мутантных опухолевых клеток, погибающих при 
последующей селекции гибридомных клеток. Стандартным подходом 
является выведение линий миеломных клеток, не способных к синтезу 
ферментов запасных путей биосинтеза пуринов и пиримидинов из ги-
поксантина и тимидина соответственно. Отбор таких мутантов опухо-
левых клеток проводят с применением токсических аналогов гипо-
ксантина и тимидина. В среде, содержащей эти аналоги, выживают 
только мутантные клетки, которые лишены ферментов, необходимых 
для запасных путей биосинтеза нуклеотидов.
2. Получение лимфоцитов – продуцентов антител к заданным ан-
тигенам. Животное (мышь, реже крысу, кролика) иммунизируют вве-
дением антигена в брюшную полость, внутривенно или подкожно. 
Для получения человеческих антител прибегают к иммунизации лим-
фоцитов человека в культуре ткани. 
3. Слияние лимфоцитов с опухолевыми клетками. Фузогенным 
фактором служит полиэтиленгликоль, вирус Сендай, мощное элек-
трическое поле. Предварительно клетки обрабатывают проназой, ней-
раминидазой. 

---

144 
4. Скрининг гибридомных клеток. Применяют селективную среду 
ГАТ, содержащую аминоптерин, блокирующий синтез нуклеотидов 
по основным путям, и предшественники запасных путей биосинтеза – 
гипоксантин и тимидин. На этой среде родительские миеломные клет-
ки погибают как генетически дефектные по ферментам запасных пу-
тей биосинтеза нуклеотидов. Родители-лимфоциты, не слившиеся с 
миеломными клетками, тоже погибают, поскольку они не способны 
расти вне организма в заданных условиях. Выживают только гибри-
домные клетки, сочетающие в себе способность к неограниченному 
росту и синтезу нуклеотидов по запасным путям. 
5. Проверка способности гибридомных клеток продуцировать мо-
ноклональные антитела к заданному антигену. Для этого используют 
иммуносорбентный анализ. Образец культуральной жидкости с гиб-
ридомными клетками каждого из полученных типов вводят в реакцию 
с соответствующим антигеном, прочно закрепленным на носителе 
(например, на пластиковой планшетке с лунками). Антигеном в дан-
ном случае может являться образец, в котором хотят обнаружить спе-
цифическую молекулу или микроорганизм. Планшетку промывают, 
чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела (они про-
дуцируются гибридомами). Для распознавания комплекса антиген – 
антитело к используемым антителам получают вторые антитела пу-
тем иммунизации этим иммуноглобулином лабораторного животного 
(например, иммуноглобулин мыши вводят в организм козы). Эти вто-
рые антитела ковалентно связывают с каким-либо ферментом (напри-
мер, с щелочной фосфатазой, уреазой или пероксидазой). Если выраба-
тываемые гибридомой антитела действительно связывают данный ан-
тиген, то добавление к ним вторых антител с пришитым ферментом 
ведет к образованию комплекса антиген – моноклональное антитело – 
антитело к моноклональному антителу – фермент. Последующее до-
бавление неокрашенного субстрата, соответствующего ферменту, за-
пускает ферментативную реакцию, протекание которой регистрируется 
по образованию окрашенного продукта. 
Существуют разновидности этого метода, в частности радиоим-
мунный и иммунофлуоресцентный анализ. Здесь антитела к иммуно-
глобулинам несут не фермент, а радиоактивную или флуоресцирую-
щую метку. 
6. Тестирование гибридом. Лунки исходной планшетки, в которой 
проводился иммуносорбентный анализ и которые дали положитель-
ную реакцию с изменением цвета (в иммуноферментном анализе), мо-
гут содержать смесь слившихся клеток. Чтобы получить линии, про-

---

145 
исходящие от одной клетки (клоны) и отличающиеся стабильностью 
по признаку образования антител, клеточную суспензию из таких лу-
нок разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После 
культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, опреде-
ляя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональ-
ные антитела, распознающие антиген-мишень. Эта процедура называ-
ется клонированием гибридомных клеток. Каждый клон, стабильно 
продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в 
культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно замо-
розить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник 
клеток. 
В настоящее время получен целый ряд моноклональных антител, 
которые используются для обнаружения различных соединений и па-
тогенных микроорганизмов. 
Альтернативой гибридомной технологии получения монокло-
нальных антител являются генноинженерные методы их получения. 

---

146 
4. ПРИМЕНЕНИЕ ДОСТИЖЕНИЙ 
МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ