Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Получение этанола и фруктозы. Как известно, рентабельность 
тех или иных биотехнологических производств во многом зависит от 
стоимости сырья, что диктует использование таких недорогих возоб-
новляемых источников углерода и энергии, как крахмал и целлюлоза. 
Их много в зерне и картофеле, которые часто служат сырьем для по-
лучения этанола и фруктозы.
Одной из дорогостоящих стадий получения названных продуктов в 
данном случае становится «осахаривание» – гидролиз поли- и олигоса-
харидов до глюкозы. В случае использования крахмала желированное 
дробленое зерно обрабатывают последовательно 
α-амилазой (гидроли-
зует доступные 
α-1,4-связи в крахмале с образованием олигосахаридов) 
и глюкоамилазой (гидролизует олигосахариды до глюкозы, ее основная 
функция – расщепление поперечных сшивок в декстринах). Получен-
ная глюкоза может затем сбраживаться дрожжами в этанол или изоме-
ризовать во фруктозу с помощью глюкоизомеразы. Таким образом, 
стоимость производства этанола и фруктозы в основном определяется 
стоимостью ферментов, которые обычно используются однократно. 
Рассмотрим пути повышения эффективности названных процес-
сов с помощью молекулярной биотехнологии. 
Из клеток грибов Aspergillus awamori выделили полноразмерную 
кДНК глюкоамилазы и встроили в одну из плазмид дрожжей Saccha-
romyces cerevisiae под контроль промотора дрожжевого гена енолазы. 
В результате отобран штамм дрожжей с глюкоамилазной активно-
стью, способный в лабораторных условиях превращать растворимый 
крахмал в этанол. Для усовершенствования этого штамма проделаны 
следующие манипуляции: 
– из промотора енолазы удалили область отрицательного контро-
ля транскрипции; 
– дрожжевую гибридную плазмиду изменили, удалив сайт ини-
циации репликации и встроив сегмент ДНК, гомологичный участку 
хромосомы дрожжей, превратив ее тем самым в интегрирующий век-
тор, который встраивается в хромосому и стабильно поддерживается 
в клетке; 
– полученную плазмиду перенесли в другой штамм дрожжей, ус-
тойчивый к высокой концентрации этанола. 
Все эти события позволили увеличить выход этанола из раство-
римого крахмала в 3 раза по сравнению с природными амилолитиче-
скими дрожжами Saccharomyces diastaticus.

---

154 
Изомеризация глюкозы во фруктозу – обратимая реакция, конеч-
ное содержание образующейся фруктозы находится в прямой зависи-
мости от температуры, которая в большинстве производственных про-
цессов составляет примерно 60
°С. Повысив температурный оптимум и 
термостабильность изомеразы, можно увеличить выход фруктозы. 
Из термофильных бактерий Thermus thermophilus выделена глю-
козоизомераза, которая активна и стабильна при 95
°С. Поскольку 
природный штамм термофилов продуцирует ее в малых количествах, 
ген глюкозоизомеразы клонировали на плазмидном векторе под кон-
тролем разных промоторов и осуществили его экспрессию в бактери-
ях E. coli и B. brevis. В клетках B. brevis удалось добиться превышения 
в 1000 раз исходной активности фермента. 
Еще одна возможность увеличения активности термостабильной 
глюкозоизомеразы состоит в повышении ее субстратной специфично-
сти. В одном из таких экспериментов исследовался фермент (глюко-
зоизомераза – это, по сути, ксилозо/глюкозоизомераза с двумя актив-
ностями: превращение D-ксилозы в D-ксилулозу и D-глюкозы в
D-фруктозу) бактерий Clostridium thermosulfurogenes. С помощью 
сайт-специфического мутагенеза заменяли нуклеотиды в составе со-
ответствующего гена. Выбор сайтов для модификации основывался на 
данных об участии соответствующих АК в связывании субстрата. За-
мена триптофага-139 на фенилаланин или валина-186 на треонин при-
водила к повышению активности фермента в отношении глюкозы в 
1,7 и 2,6 раза соответственно и к ее уменьшению по отношению к 
ксилозе в 2 и 7 раз. При одновременной замене двух АК каталитиче-
ская активность в отношении глюкозы повысилась в 5,7 раза, а в от-
ношении ксилозы снизилась в 4,5 раза. Это пример белковой инжене-
рии; полученный продуцент можно использовать для промышленного 
производства фермента.