Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Производство витаминов. Другой пример успешного использо-
вания методологии генетической инженерии для создания промыш-
ленного продуцента первичного метаболита – это конструирование 
продуцента витамина В
2
(рибофлавина) на базе Bacillus subtilis. Скон-
струирован специальный вектор для клонирования генов в бациллах. 
Семь генов, ответственных за биосинтез рибофлавина, сгруппированы 
у Bacillus subtilis в одном участке ДНК размером 6,3 кДа. Мутации, 
дерепрессирующие активность рибофлавинового оперона, были полу-
чены путем селекции штаммов, устойчивых к аналогам рибофлавина. 
Клонирование мутантного рибофлавинового оперона на плазмидном 
векторе с последующей селекцией привело к созданию штамма Bacil-
lus subtilis, способного за 25–35 ч ферментации в условиях аэрации 
продуцировать в КЖ 3,5–4,5 г/л витамина В
2
. В качестве источника 
углерода используется сахароза или меласса. Для сравнения гриб Ere-
mothecium ashbyi, который использовался в СССР для промышленного 
получения рибофлавина, за 70 ч ферментации образует всего 2 г/л ви-
тамина В
2
. 
Еще один пример касается получения витамина С (L-аскорбино-
вой кислоты). В настоящее время для крупномасштабного получения 
витамина С используют трудоемкий процесс, включающий одну мик-
робиологическую стадию и несколько химических; исходный суб-
страт – D-глюкоза (рис. 4.1). 

---

150 
Рис. 4.1. Промышленное получение аскорбиновой кислоты:
D-глюкоза 
→ каталитическое восстановление до D-сорбитола → окисление
с помощью сорбитолдегидрогеназы (клетки Acetobacter suboxydans)
в L-сорбозу 
→ химическое окисление в 2-кето-L-гулоновую кислоту (2-КЛГ) →
→ перевод в натриевую соль 2-КЛГ → обработка кислотой
до образования L-аскорбиновой кислоты 
Оказалось, что 2-КЛГ можно получить и другим путем: бактерии 
Acetobacter, Gluconobacter, Erwinia могут превращать глюкозу в 2,5-ди-
кето-D-глюконовую кислоту, а другие (Corynebacterium, Brevibacte-
rium, Arthrobacter) – преобразовывать это соединение в 2-КЛГ. 
Можно было бы усовершенствовать существующую технологию 
совместным культивированием названных бактерий, но это не всегда 
возможно, т. к. они растут при разных рН, температуре и т. п. После-
довательное культивирование не позволит сделать процесс непрерыв-
ным. Наилучший выход – создание гибридного штамма, сочетающего 
в себе гены обеих бактерий. Выяснено, что Erwinia herbicola осуще-
ствляет превращение глюкозы в 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту в 
ходе нескольких стадий (разные ферменты), а Corynebacterium sp. 
превращают 2,5-дикето-D-глюконовую кислоту в 2-КЛГ в одну ста-
дию (рис. 4.2). Поэтому проще перенести ген 2,5-дикето-D-глюконо-
вой кислоты-редуктазы Corynebacterium sp. в эрвинии и создать но-
вый микроорганизм. 
D-глюкоза 
D-сорбитол
L-сорбоза
L-аскорбиновая кислота

---

151 
Рис. 4.2. Микробный синтез 2-КЛГ 
Из Corynebacterium sp. выделили и очистили 2,5-дикето-D-глюко-
новой кислоты-редуктазу и определили последовательность ее первых 
40 N-концевых аминокислот. Исходя из этих данных синтезировали 
два 43-нуклеотидных гибридизационных зонда, соответствующих 
разным частям белковой молекулы. Зонды использовали для скринин-
га банка генов Corynebacterium sp. Выделили клон, содержащий ген 
2,5-дикето-D-глюконовой кислоты-редуктазы, и секвенировали ген. 
Нуклеотидные последовательности, расположенные до стартового кодо-
на АТG, вырезали и заменяли их сигналами транскрипции и трансляции, 
функционирующими в E. coli, поскольку регуляторные последовательно-
сти грамположительных микроорганизмов типа Corynebacterium spp. не 
функционируют в клетках кишечной палочки. Полученную конструкцию 
вводили в E. coli (при этом синтезировалась активная редуктаза), а затем 
переклонировали в векторе с широким кругом хозяев и трансформирова-
ли им Erwinia herbicola. 
Трансформированные клетки эрвиний активно превращали 
D-глюкозу непосредственно в 2-КЛГ. Полученный гибрид приобрел 
D-глюкоза 

---

152 
способность синтезировать конечный продукт комбинированного ме-
таболического пути. Позже была увеличена коммерческая ценность 
редуктазы путем аминокислотных замен, повышающих ее каталити-
ческую активность и термостабильность.
Исходя из аминокислотной последовательности этого фермента 
была воссоздана его вторичная структура, состоящая из восьми па-
раллельных 
β-слоев, перемежающихся восьмью α-спиралями, кото-
рые соединялись с 
β-слоями петлями разной длины (рис. 4.3).
Рис. 4.3. Структура 2,5-дикето-D-глюконовой кислоты-редуктазы,
воссозданная исходя из ее аминокислотной последовательности
(стрелки – β-слои; полоски – α-спиральные участки;
кружки – аминокислотные остатки; желтый кружок –
192-й аминокислотный остаток) 
Такой характер укладки полипептидной цепи был установлен для 
17 других ферментов с уже известной кристаллической структурой, и 
по аналогии с ними были идентифицированы три петли, предположи-
тельно участвующие в связывании субстрата. С помощью олигонук-
леотид-направленного мутагенеза было получено 12 мутантных бел-
ков, каждый из которых содержал одну аминокислотную замену в од-
ной из петель. Двенадцатая мутантная форма, у которой остаток 
глутамина в положении 192 был заменен на аргинин, была примерно в 
2 раза более активной. Замена глициновых остатков в положениях 55 

---

153 
и 57 на аланиновые позволила получить более термостабильный фер-
мент по сравнению с нативной формой (пример белковой инженерии).