Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Ферментативный синтез генов. Возможны два принципиаль-
но различающихся способа ферментативного синтеза ДНК. Один из 
них не требует присутствия матрицы и осуществляется по про-
грамме, задаваемой экспериментатором. Такой синтез катализирует 
бактериальный фермент полинуклеотидилфосфорилаза, специфич-
ный в отношении рибонуклеотидов, но способный и к полимериза-
ции цепей ДНК с меньшей скоростью. Для такого синтеза необхо-
дим праймер, включающий не менее 3 нуклеотидов. Реакции поли-
меризации имеют некоторые ограничения и с трудом поддаются 
контролю. 
Другой способ ферментативного синтеза ДНК предполагает уча-
стие матрицы, которой на первом этапе служит мРНК, выделенная из 
клетки. Практически все мРНК эукариот имеют на 3
′-конце «шлейф» 
(полиаденилатную последовательность). Этот участок используют для 
образования затравки для комплементарной цепи ДНК: к мРНК до-
бавляют короткие последовательности, состоящие из тимидилатов, 
которые в результате отжига гибридизуются с полиаденилатами 
(рис. 2.3). Обратная транскриптаза в присутствии набора дезоксири-
бонуклеотидов катализирует их присоединение к затравке в последо-
вательности, определяемой мРНК, в результате чего образуется двух-
нитевый гибрид РНК-ДНК. По не выясненным пока причинам (по-
видимому, из-за того, что фермент «поворачивает вспять») новосин-
тезированная цепь ДНК имеет на конце шпильку (рис. 2.3), которая 
возникает только при реакции in vitro. Эту шпильку используют в 
качестве затравки для синтеза второй цепи ДНК. На следующем эта-
пе осуществляют деградацию РНК с помощью рибонуклеаз либо в 
ходе щелочного гидролиза, а оставшуюся однонитевую ДНК со 
шпилькой используют как матрицу для синтеза второй цепи ДНК 
(ДНК-полимераза І). На заключительном этапе шпильку расщепляют 
с помощью нуклеазы S1, которая специфически гидролизует одноце-
почечные участки нуклеиновых кислот. Так образуется двухцепочеч-
ная «комплементарная» ДНК, или кДНК (в названии отражено основ-
ное ее отличие – комплементарность мРНК). 
Существуют модификации описанного метода, позволяющие 
избежать многих его недостатков, в частности синтеза неполных 
копий РНК (особенно в случае длинных мРНК). Одной из таких 
разновидностей метода является синтез кДНК непосредственно на 
векторе. 

---

89 
Рис. 2.3. Образование кДНК в ходе
ферментативного синтеза на основе мРНК