Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

робактериальной трансформации. Его суть состоит в следующем: 

---

102 
in vitro с использованием всех описанных выше закономерностей кон-
струируют гибридную плазмиду широкого круга хозяев с нужной 
вставкой. В состав такой векторной плазмиды обязательно включают 
сайт ori, позволяющий ей реплицироваться в клетках E. coli и Agro-
bacterium sp., и, кроме того, две области так называемой Т-ДНК, про-
исходящих из Ti-плазмиды агробактерий. Между двумя плечами
Т-ДНК встраивают гены, которые хотят перенести в клетки растений. 
Как показано, именно Т-ДНК в ходе сложного механизма в виде од-
нонитевой ДНК вырезается из Ti-плазмиды агробактерий и перено-
сится в растение. Этот процесс имеет место в природе при индукции 
опухолей у растений, за образование которых как раз и отвечает
Ti-плазмида агробактерий.
В бактериях E. coli осуществляют клонирование необходимых ге-
нов и отбор клеток с желаемой конструкцией. Затем отобранные гиб-
ридные ДНК переносят в клетки высоковирулентных для растений 
Agrobacterium tumefaciens, в которых уже содержится специально 
сконструированная Ti-плазмида, не содержащая Т-ДНК. Когда такими 
агробактериями инфицируют растения, vir-участок Ti-плазмиды обу-
словливает события вырезания Т-нити вместе со вставкой из вектора и 
перенос ее в клетки растения. 
Данная технология введения гибридных ДНК в клетки растений 
весьма эффективна, но ее ограничением является круг хозяев агробак-
терий, который, впрочем, можно расширить, используя для трансфор-
мации специально отобранные штаммы этих бактерий с широким кру-
гом хозяев. 
2.3. Создание и скрининг клонотек 
В большинстве случаев для изучения структуры и свойств опре-
деленного гена какого-либо организма требуется осуществить предва-
рительный этап – создать банк генов данного организма. Банком ге-
нов, или библиотекой генома (клонотекой), называют совокупность 
клонов бактерий или фаговых частиц, в которой содержится, по 
меньшей мере, по одному экземпляру каждой последовательности ге-
нома исследуемого организма. Необходимое количество клонов в 
клонотеке определяется отношением размера генома к размерам кло-
нируемых фрагментов ДНК. Например, если гаплоидный геном 
Saccharomyces cerevisiae содержит 1,4 
⋅ 10
4
т. п. н., а емкость исполь-
зуемого для клонирования вектора составляет 15 т. п. н., то весь геном 
этих дрожжей может быть представлен 1,4 
⋅ 10
4
/15 
≈ 1 ⋅ 10
3
рекомби-

---

103 
нантными клонами. Однако реально для создания клонотеки в данном 
случае требуется 4000–5000 клонов, среди которых искомый ген или 
сегмент генома может быть обнаружен с вероятностью 99%. Такая из-
быточность клонотеки объясняется тем, что лигирование отдельных 
фрагментов чужеродной ДНК с векторами происходит случайно, и ка-
кие-то участки генома могут быть представлены в небольшой выборке 
несколько раз, а другие – ни одного раза. Полная библиотека генома 
человека размещается в составе примерно 900 000 клонов. 
Наиболее часто используются два типа клонотек – геномные биб-
лиотеки и библиотеки кДНК. Геномные библиотеки представляют со-
бой собрание генов и последовательностей ДНК какого-то организма. 
Их получают обычно с помощью векторов, сконструированных на ос-
нове бактериофага 
λ или космид. Эти векторы характеризуются боль-
шой емкостью, что позволяет уменьшить число клонов в клонотеке. 
Библиотека кДНК (комплементарных ДНК) представлена набо-
ром клонов, содержащих двухнитевые ДНК-копии всех мРНК клетки. 
Для создания этих клонотек чаще используют плазмидные или фаго-
вые (на основе фага 
λ) векторы. 
Оба типа клонотек, однако, можно сравнить с хаотическим собра-
нием книг, которые превращаются в библиотеку лишь после составле-
ния каталога, позволяющего систематизировать все собрание. Иными 
словами, следующим необходимым этапом является идентификация 
генов в клонотеке генома. Решить эту задачу можно несколькими спо-
собами: анализируя саму вставочную полинуклеотидную последова-
тельность либо продукты ее экспрессии в клетках хозяина. В первом 
случае стратегия скрининга рекомбинантных клонов основана на ис-
пользовании зондов, комплементарных определенным участкам генов 
или кДНК. Во втором случае скрининг основан на изменении фенотипа 
клеток, воспринявших определенный фрагмент ДНК, под влиянием 
вновь синтезированного белка либо просто на свойствах самого белка. 
Рассмотрим некоторые способы идентификации генов в клонотеках.