Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Скрининг клонотеки с помощью зондов. Этот метод основан на 
гибридизации комплементарных участков нуклеиновой кислоты. 
В подразд. 2.2 описана процедура получения кДНК. Для поиска нуж-
ной кДНК в клонотеке поступают следующим образом. Отбирают 
изолированную колонию, содержащую вектор со вставкой, и инкуби-
руют ее для получения большого количества гомогенной культуры. 
Выделяют из клеток плазмидную ДНК и подвергают ее денатурации, 
в результате чего цепи расходятся. Иммобилизуют денатурированную 
ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Пропускают через фильтр смесь 
мРНК, выделенных из тех же клеток, чьи гены пытаются обнаружить. 
При этом на фильтре задерживаются лишь те мРНК, которые компле-
ментарны гомогенной кДНК. Связавшуюся мРНК элюируют с фильт-
ра и вносят в бесклеточную систему трансляции, где синтезируется 
соответствующий белок. Этот белок можно идентифицировать имму-
нологическим методом или с помощью хроматографического анализа. 
Если это удается осуществить, в руках исследователя оказывается 
идентифицированный клон, клетки которого содержат кДНК, служа-
щую зондом для поиска индивидуального гена или мРНК.
Этот кДНК-зонд можно использовать для быстрого и очень эф-
фективного скрининга любой клонотеки. Схема такого эксперимента 

---

105 
представлена на рис. 2.8. Изолированные колонии микроорганизмов или 
бляшки вирусов на газоне чувствительных клеток переносят методом 
реплик на нитроцеллюлозный фильтр, помещенный на поверхность 
плотной среды в чашке Петри. Клетки разрушают (обычно щелочным 
лизисом с помощью NaOH) и подвергают ДНК денатурации. При опре-
деленных условиях (80
°С, вакуум) ДНК прочно прикрепляется к нитро-
целлюлозному фильтру. Фильтр выдерживают в растворе, содержащем 
денатурированный 
32
Р-меченный зонд. В этих условиях комплементар-
ные последовательности ДНК образуют дуплексы. При радиоавтогра-
фическом анализе в том месте фильтра, где содержалась комплементар-
ная зонду ДНК, обнаруживается потемнение. Ищут соответствие этой 
зоны той или иной колонии на чашке-матрице (либо бляшке). 
Рис. 2.8. Схема процесса скрининга клонотеки с помощью зондов 
 
В качестве зондов для скрининга клонотек вместо кДНК можно 
использовать мРНК или химически синтезированные олигонуклео-
тидные зонды. В последнем случае требуется информация о последо-
вательности нуклеотидов в гене или последовательности аминокислот 

---

106 
в искомом белке. Исходя из аминокислотной последовательности уча-
стка полипептида длиной 5–6 аминокислотных остатков, предсказы-
вают все возможные последовательности мРНК, которые могут коди-
ровать этот участок. Из-за вырожденности генетического кода вари-
антов обычно бывает много.
Синтезируют соответствующий набор комплементарных олиго-
нуклеотидов in vitro. Эти нуклеотиды затем можно использовать не-
посредственно для скрининга смеси кДНК или геномной библиотеки. 
Кроме этого, данные олигонуклеотиды можно применять вместо оли-
готимидилатов в качестве затравок для обратной транскриптазы, что-
бы синтезировать кДНК, существенно обогащенную искомыми по-
следовательностями. В данном случае процессу обратной транскрип-
ции будут подвергаться преимущественно те мРНК, которые содержат 
комплементарные затравкам последовательности рибонуклеотидов. 
2.4. Характеристика
продуктов клонирования 
После отбора клеток, содержащих клонированные фрагменты 
ДНК, необходимо охарактеризовать эти фрагменты, убедившись в 
следующем: 
– гибридная ДНК содержит нужный сегмент; 
– нужный сегмент ДНК включился в состав вставки целиком; 
– сегмент полностью соответствует геномной ДНК, из которой 
происходит; 
– нужная последовательность является функциональной. 
Чтобы получить возможность убедиться в этом, следует вначале 
отделить гибридную ДНК (векторные плазмиды со вставками или фа-
говые ДНК) от хромосомальной ДНК бактерий, от РНК и белков.
Для этого из клеток экстрагируют ДНК, используя такие методы, 
при которых небольшие кольцевые плазмидные ДНК сохраняют це-
лостность, а крупные хромосомальные ДНК разрываются на линей-
ные фрагменты. Фаговую ДНК получают в свободном от клеточной 
ДНК состоянии путем очистки фаговых частиц и последующего вы-
деления из них ДНК. От РНК и белков освобождают ферментативным 
расщеплением.