Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Определение последовательности нуклеотидов в ДНК (секве-
нирование). Определение последовательности нуклеотидов в ДНК 
является одной из важных, а часто и обязательных стадий изучения 
генома. Секвенированию подвергают очищенные (однородные) фраг-

---

110 
менты однонитевой ДНК длиной 100–200 нуклеотидов. Получить та-
кие фрагменты можно в ходе следующих операций: методом клони-
рования добиваются однородности рекомбинантных ДНК в составе 
одного клона; выделяют векторную ДНК из клеток; с помощью рест-
рикционных ферментов расщепляют клонированный сегмент ДНК на 
фрагменты указанной величины; при повышении температуры доби-
ваются денатурации ДНК, получая однонитевые молекулы. Есть и бо-
лее простой способ подготовки ДНК (пригоден для метода Сэнгера) – 
клонирование однонитевых фрагментов ДНК в составе векторов на 
основе фага М13. 
Широко применяются два метода секвенирования – метод хи-
мического расщепления Максама и Гилберта и метод обрыва цепи 
Сэнгера. Наиболее современным и менее трудоемким считается 
метод обрыва цепи Сэнгера, который разработан в 1977 г. Ф. Сэн-
гером как усовершенствованный метод, пришедший на смену ра-
нее предложенному Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном (1975 г.) «плюс-
минус»-методу. 
Секвенирование ДНК методом обрыва цепи. Иначе этот метод 
называется дидезокси-методом Сэнгера. В методе происходит фер-
ментативное копирование при помощи Роl-I исходного одноцепо-
чечного сегмента ДНК с точки, задаваемой положением 3
′-конца 
праймера. Метод основан на использовании специфических термина-
торов синтеза ДНК – 2
′,3′-дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Эти 
молекулы нормально включаются в растущие цепи ДНК через свои 
5
′-трифосфатные группы, однако не образуют фосфодиэфирную 
связь со следующим дезоксирибонуклеозидтрифосфатом (dNTP). Ко-
гда в реакционную смесь для синтеза ДНК наряду с четырьмя нор-
мальными dNTP вводят небольшое количество какого-либо ddNTP 
(например, ddATP), синтезируется набор цепей, специфически тер-
минированных данным ddNTP. Если с одним и тем же фрагментом 
ДНК поставить четыре отдельные реакции, каждую с одним из 
ddNTP, то в любой из реакций образуется смесь вновь синтезирован-
ных молекул разной длины. При этом получается, что все синтезиро-
ванные в такой системе цепи ДНК будут иметь одинаковый 5
′-конец 
(он обусловлен использованием одной и той же затравки) и одинако-
вые нуклеотиды на 3
′-конце. Теперь такие продукты можно разде-
лить с помощью электрофореза в геле и определить по относитель-
ной длине образованных цепочек ДНК последовательность нуклео-
тидов в них (рис. 2.10). 

---

111 
Рис. 2.10. Схема процесса секвенирования методом обрыва цепи 
Последовательность этапов в методе следующая:
1) получают однонитевые фрагменты ДНК, последовательность 
нуклеотидов в которых требуется определить (ДНК-матрицы);
2) синтезируют набор ddNTP;
3) синтезируют короткий фрагмент меченой ДНК, комплементар-
ный 3
′-концу матрицы (затравка);
4) готовят четыре реакционные смеси для синтеза ДНК, в состав 
каждой из которых входит какой-либо один ddNTP и соответствующий 
dNTP в строго определенном соотношении, а также три других dNTP;
5) в каждой из реакционных смесей дают осуществиться синтезу 
ДНК. Если соотношение ddNTP : dNTP выбрано правильно, образует-
ся набор меченых молекул, длины которых равны расстояниям от ос-
татков данного ddNTP до начала цепи;
6) денатурируют полученные смеси ДНК, добиваясь образования 
однонитевых молекул;
7) разделяют фрагменты по размеру методом электрофореза в ге-
ле (в пористом агарозном или полиакриламидном геле под действием 
электрического поля молекулы движутся со скоростью, обратно про-
порциональной их величине);
8) проводят радиоавтографию и по картине распределения мече-
ных фрагментов устанавливают нуклеотидную последовательность. 

---

112 
Наиболее современной модификацией метода Сэнгера является 
использование клонированных в векторах на основе фага М13 одно-
нитевых фрагментов ДНК. Место генома М13, в которое встраивается 
чужеродная ДНК, точно известно. Поэтому получены 8–10-членные 
олигонуклеотиды, комплементарные участку ДНК векторов М13, не-
посредственно прилегающему к клонированной последовательности. 
Эти нуклеотиды и служат затравками в полимеразных реакциях, т. е. 
появляется возможность использования одной и той же синтетической 
затравки для секвенирования любых вставок в данный вектор. При 
оптимальных условиях с помощью данного метода можно в одном 
эксперименте определить строение фрагмента, включающего сотни 
нуклеотидов.
Однако для секвенирования очень длинных фрагментов ДНК 
(более 5 т. п. н.) описанный подход неприменим, поскольку число
М13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные по-
следовательности, значительно увеличивается. Для решения этой задачи 
были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных 
ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК со вставкой 
выделяют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, 
который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей век-
торной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют диде-
зокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250–
350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй 
олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, от-
стоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого 
праймера, и секвенируют следующие 250–350 нуклеотидов. Аналогич-
ным образом синтезируют третий праймер и определяют последова-
тельность следующих 250–350 нуклеотидов. Эту процедуру, называе-
мую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока 
не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вто-
рую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью 
вблизи вставки. 
 
2.5. Экспрессия трансгенов 
Одним из наиболее значимых достижений генетической инжене-
рии является клонирование эукариотических генов, что дает возмож-
ность осуществлять синтез микробными клетками важнейших для на-
родного хозяйства белков – ферментов, гормонов, иммуномодуляторов 
и др. Эукариотические организмы – доноры генетического материала 

---

113 
характеризуются гораздо менее высоким уровнем продукции природ-
ных белков, чем генноинженерные штаммы-продуценты. Поэтому по-
лучение практически ценных белков для изучения их структуры и 
свойств, а также для использования в хозяйственных целях осуществ-
ляют чаще с использованием гибридных микробных штаммов, а не 
культур клеток растений и животных или их органов и тканей. На-
званным способом получены такие ценные белки, как гормон роста 
человека и некоторых животных, инсулин, фактор роста эпидермиса 
человека, фактор некроза опухолей человека и мыши, 
α-, β- и γ-интер-
фероны, медиатор нервной системы соматостатин, гормон кальцито-
нин, миоглобин, гормоноподобные сигнальные белки интерлейкины, 
фактор свертывания крови, отсутствующий у больных гемофилией, 
обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей, урокиназа, трипсин, 
некоторые онкобелки, вакцины против некоторых вирусов.
Когда ген в составе векторной молекулы переносится из клеток 
одного организма в клетки другого, возникают проблемы с его экс-
прессией: транскрипция и трансляция мРНК могут не осуществляться 
вовсе либо происходить с низкой частотой. Это является следствием 
специфичности ферментов, катализирующих процессы транскрипции 
и трансляции, к определенным последовательностям ДНК (мРНК), 
структура которых бывает уникальной у различных таксономических 
групп организмов. Чаще всего проблемы экспрессии наблюдаются 
при клонировании эукариотических генов в клетках прокариот, в част-
ности потому, что сигналы инициации транскрипции высших эукариот 
не распознаются РНК-полимеразами бактерий. 
Для достижения эффективной экспрессии клонированных генов 
используют несколько подходов:
1) увеличение числа копий гена в клетке (амплификация гена): 
если изучаемый ген находится в клетке в высокой дозе, он обычно 
обусловливает повышенный уровень своего белкового продукта;
2) подстановку перед структурной частью чужеродного гена 
сильного промотора, распознаваемого РНК-полимеразой клетки хо-
зяина, что обеспечивает эффективную транскрипцию трансгена; 
3) подстановку перед геном чужеродного белка регуляторного 
элемента, обеспечивающего эффективную инициацию трансляции; 
4) стабилизацию образующейся мРНК и белкового продукта. 
Перечисленные методы достижения высокого уровня экспрессии 
генов наилучшим образом разработаны для бактерий E. coli. Посколь-
ку наличие такой методологии является определяющим условием 
конструирования новых продуцентов, кишечная палочка рассматрива-

---

114 
ется как один из самых перспективных организмов, используемых для 
этой цели.