Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Измерение длины с помощью электронной микроскопии. Поль-
зуются специальным приспособлением к микроскопу, которое позво-
ляет определить длину денатурированной молекулы ДНК. 
Вырезание вставки с помощью рестриктаз. Применяют те 
же рестриктазы, которые использовались при клонировании. Опре-
деляют размеры фрагментов с помощью гель-электрофореза. Если 
клонирование осуществлялось с лигированием «тупых» концов, то 
можно разрезать векторную молекулу по сайтам, находящимся в 
участках, фланкирующих вставку, и тоже определить размеры 
фрагментов в гель-электрофорезе. Потом можно вычесть размеры 
фланкирующих областей, которые обычно бывают известны (по-
ложение сайтов рестрикции в векторах известно при их конструи-
ровании). Наконец, можно крупную молекулу разрезать на множе-
ство фрагментов, определить их размер и из суммы вычесть размер 
самого вектора. 
Картирование сайтов для эндонуклеаз рестрикции. С по-
мощью эндонуклеаз II типа можно разрезать сложные геномы или 
длинные сегменты ДНК на воспроизводимые наборы мелких еди-
ниц. Эти единицы можно разделить по размерам с помощью, на-
пример, электрофореза в полужидком геле на основе агарозы (для 
относительно крупных фрагментов) или полиакриламида (для бо-
лее мелких). При определении фрагментов, которые получаются 
при расщеплении ДНК несколькими рестриктазами по отдельности 
и в разных комбинациях, часто удается установить порядок распо-
ложения сегментов в исходной молекуле, т. е. построить физиче-
скую карту ДНК, где указано положение каждого сегмента. Для 
сложных геномов или больших молекул, которые дают при рест-
рикции сложные наборы фрагментов, используют специальные 
компьютерные программы.
Определение положения нужного сегмента во вставке. После 
построения рестрикционной карты вставки установить точную ло-
кализацию нужного сегмента не составляет труда. Для этого нужен 
только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК- или РНК-

---

109 
зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования. Ес-
ли такой зонд имеется, то интересующий нас фрагмент можно обна-
ружить при отжиге зонда с фрагментами после их денатурации. 
Чтобы выявить гибрид, нужно использовать меченый зонд. Чаще 
всего его метят радиоактивным фосфором (
32
Р).
Гибридизация меченого зонда с фрагментами ДНК, находящими-
ся в геле, происходит очень неэффективно, поэтому почти во всех 
случаях ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подхо-
дящую твердую подложку (обычно на нитроцеллюлозный фильтр или 
нейлон). Этот метод носит название «блоттинг». Блоттинг ДНК на-
зван блоттингом по Саузерну, или саузерн-блоттингом (по имени изо-
бретателя); соответствующие методики для РНК и белков получили 
название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга. 
Суть метода состоит в следующем. Исследуемую ДНК расщеп-
ляют рестриктазами на фрагменты, которые разделяют по размеру 
в ходе электрофореза в агарозном геле. Затем гель помещают на 
нитроцеллюлозный фильтр и пропускают через него соответ-
ствующий буферный раствор в направлении, перпендикулярном 
направлению электрофореза. При этом фрагменты ДНК элюируют-
ся из геля и связываются с нитроцеллюлозным фильтром, на кото-
ром в результате получается реплика геля (на ней фрагменты со-
храняют свое взаимное расположение). Далее инкубируют под-
ложку в растворе, содержащем 
32
Р-зонд, при такой ионной силе и 
температуре, которые обеспечивают образование водородных свя-
зей между зондом и комплементарным фрагментом ДНК. После 
радиоавтографии выявляется набор полос, соответствующих фраг-
ментам ДНК, гибридизующихся с зондом (комплементарных ему), 
т. е. содержащих искомый сегмент. 
Кроме этого, положение искомой последовательности в клониро-
ванном сегменте можно определить с помощью электронной микро-
скопии. Для этого зонд и рекомбинантную ДНК смешивают, денату-
рируют и отжигают, а затем готовят препарат для микроскопирова-
ния. Комплементарные участки зонда и исследуемой молекулы 
образуют дуплексы, которые на микрофотографиях выглядят как от-
носительно толстые нити, а некомплементарные участки остаются од-
ноцепочечными и имеют вид более тонких нитей.