Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Амплификация генов. Для усиления экспрессии генов можно 
увеличить их количество в клетке. Осуществляют это двумя способа-
ми – увеличением числа копий рекомбинантных плазмид или числа 
копий гена в составе плазмиды. 
Наиболее прост первый способ. Уже указывалось, что для конст-
руирования векторов предпочтительнее использовать мультикопий-
ные плазмиды, находящиеся под нестрогим контролем репликации. 
В этом случае число копий плазмид составляет 10–200. Данный пока-
затель можно увеличить до нескольких тысяч, если подавить синтез 
белков бактериальной клетки или использовать мутантные плазмиды. 
Применение таких векторов позволяет значительно увеличить дозу 
целевого гена, а значит, и выход белкового продукта. Для конструи-
рования многокопийных плазмидных векторов используют либо 
плазмиды с ослабленным контролем репликации, либо с термочувстви-
тельными мутациями по функциям репликации. Из векторов первого 
типа широкое распространение получила плазмида ColE1 и ее произ-
водные, которые в обычных условиях находятся в клетке в количестве 
20–60 копий. В частности, при клонировании бактериальных генов в 
известной нам pBR322 (производная ColE1) уровень синтеза белков 
возрастает в 25–100 раз. По-видимому, это обусловлено тем, что дан-
ный вектор в клетках E. coli имеет большую копийность, чем сама 
ColE1. Интересным свойством плазмид этого класса является то, что в 
присутствии ингибитора белкового синтеза – хлорамфеникола копий-
ность их может увеличиться до 3·10
3
молекул на клетку (около поло-
вины суммарной клеточной ДНК). Однако достичь пропорционально-
го увеличения продукции химерного белка не удается, т. к. обработка 
хлорамфениколом ингибирует белковый синтез в клетках. После уда-
ления из среды хлорамфеникола белковый синтез и деление клеток 
возобновляются и кратковременно увеличивается продукция белка, 
пока копийность гибридной плазмиды постепенно не снизится. 
При использовании термочувствительных мутантов плазмид син-
тез белка не ингибируется, что приводит к сверхпродукции белков, 
детерминируемых генами плазмиды. Например, мутантный фактор 
устойчивости к антибиотикам R1 использован для конструирования 
миниплазмид рKN402 и рKN410, обладающих способностью к безу-
держной репликации при температуре выше 35
°С. В результате ам-
плификации в течение 2–3 ч количество плазмидной ДНК может дос-
тигнуть 75% суммарной ДНК клетки. 

---

115 
Следует, однако, учитывать, что чрезмерная амплификация плаз-
мид может приводить к снижению жизнеспособности штамма-
продуцента из-за высокой токсичности некоторых чужеродных белков 
для бактерий, а также из-за увеличения времени генерации клеток. 
Копийность генов в составе векторных молекул также обеспечива-
ют, создавая опероны с повторяющимися идентичными цистронами чу-
жеродных генов. Сочетание перечисленных методов позволяет повы-
сить дозу гена в клетке до тысяч копий на нуклеоид и увеличить уровень 
синтеза соответствующих белков (в ряде случаев на 1–2 порядка).