Microsoft Word 60 2012 Белясова doc
Download 5.01 Kb. Pdf ko'rish
|
belyasova molekulyarnaya biotexnologiya
|
Фазмиды. Это тоже гибридные векторы, способные развиваться и
как фаг, и как плазмида, поскольку содержат в составе все гены, необ- ходимые для литического цикла, а также гены, нужные для реплика- ции плазмиды. Емкость фазмид меньше, чем космид, и сопоставима с Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Eco RI Tet-r Tet-r + Eco RI 97 таковой для фаговых векторов. Преимуществом фазмид является то, что размер их ДНК слишком мал, чтобы мономер мог упаковаться в капсид фага λ, в то же время слишком велик, чтобы произошла упа- ковка димера вектора. Поэтому негативные колонии способны фор- мировать только рекомбинантные фазмиды, поскольку их размеры со- ответствуют емкости головки фага λ. Вставка в фазмиду чужеродного фрагмента ДНК осуществля- ется подобно уже описанным примерам для других векторов, ча- ще – по сайтам рестрикции. После этого гибридные фазмиды упа- ковывают в капсиды in vitro, как описано выше. При инфицирова- нии чувствительных клеток фазмиды обусловливают литический цикл и формируют бляшки на газоне тест-культуры. Однако если вектор содержит ген сI, кодирующий структуру белка-репрессора, то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Часто в со- ставе фазмид используют мутантные гены сI, определяющие структуру температурочувствительного белка-репрессора, который инактивируется при повышенной температуре. В этом случае фаз- мида ведет себя как плазмида при низкой температуре, а при по- вышении температуры на несколько градусов индуцируется к ли- тическому циклу. Такое свойство фазмид во многих случаях ока- зывается очень полезным. Свойствами фазмид обладают некоторые бактериофаги, например фаг Р1, который в состоянии профага не интегрирует в хромосому, а поддерживается в виде плазмиды. Мутант фага Р1clr100 способен ин- дуцироваться к литическому циклу при температуре выше 32 °С, т. е. ведет себя как типичная фазмида. Выше охарактеризованы типы векторов, используемых для кло- нирования генов в клетках E. coli. Для других видов прокариот так- же сконструировано множество различных векторных молекул, сре- ди которых обращают на себя внимание так называемые челночные векторы. Их особенность состоит в способности к репликации в разных клетках хозяина, что обеспечивается введением в вектор до- полнительных областей начала репликации (ori), а также генов, тре- буемых для репликации и не поставляемых хозяйскими клетками. Одни из челночных векторов способны поддерживаться в клетках разных прокариот, другие – в клетках некоторых прокариот и эука- риот (дрожжей, растений, животных). Использование челночных векторов обеспечивает удобство клонирования генов и анализа их продуктов, поскольку одни и те же гены получают возможность ре- плицироваться и экспрессироваться в разных организмах. 98 Одним из примеров конструирования челночных векторов явля- ется объединение части 2 мкм (двухмикронной) плазмиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae с плазмидой pBR322, содержащей дрожже- вой ген HIS3 (кодирует один из ферментов биосинтеза гистидина). Оказалось, что ген HIS3 экспрессируется и в бактериальных клетках благодаря тому, что содержит область, гомологичную соответствую- щему промотору E. coli. Такой вектор реплицируется в клетках дрож- жей S. cerevisiae и в бактериях E. coli и позволяет осуществлять пря- мой отбор воспринявших его клеток при использовании гистидин- зависимых штаммов на синтетической среде без этой аминокислоты. Основой векторов для клонирования генов животных чаще всего является геном вируса обезьян SV40. Общие принципы конструирова- ния векторов в этом случае такие же, как для векторов на основе фага λ. Для растительных клеток, которые не содержат собственных плазмид, основой векторов часто служат геномы вирусов растений, а также бактериальная плазмида pTi, которая опосредует перенос сег- ментов плазмидной ДНК в геномы различных двудольных растений и индуцирует образование опухолей (корончатых галлов). Семейство плазмид pTi выявлено в грамотрицательных бактериях Agrobacterium tumefaciens. 2.2. Клонирование генов Термин «клонирование» происходит от слова «клон», под кото- рым подразумевается генетически однородное потомство клеток или вирусов, т. е. полученное при неполовом размножении. Простейшим примером клона является изолированная колония бактерий на плот- ной среде. Когда говорят о клонировании гена, имеют в виду тиражи- рование копии гена в составе векторной молекулы в клетках клона (или вирусных частицах в составе бляшки). При этом каждая клетка клона (каждая вирусная частица в пределах изолированной негатив- ной колонии) будет содержать одинаковые фрагменты чужеродной ДНК. Это очень важный методологический прием, составляющий ос- нову всей генетической инженерии. Ведь при получении генов в ходе расщепления ДНК какого-то организма и включении полученных фрагментов в состав векторов формируется очень сложная смесь мо- лекул, в которой один ген или его сегмент составляет ничтожную Download 5.01 Kb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|