O`zbekiston Raspublikasi Oliy va o`rta-maxsus ta`lim vazirligi

1.2.Pro- va eukariot gen elementlarining asosiy tuzilishi
Ba’zi ishlarda [Lobzin i CHechetkin, 2000; Chechetkin and Lobzin, 1998] bakteriofagning PHIX174 genomli ketma−ketligi uchun spektr ma’lumotlari keltirilgan. Bakteriofag genomida 3 davriylik borligi ko‘rsatilgan, deyarli barcha ketma-ketlik oqsillarni kodlaydi. Furening sonli ketma-ketlik uchun umumiy spektri individual spektrlarning yig‘indisi sifatida ifodalanadi. Furening sonli ketma-ketliklar uchun umumiy spektri individual spektrlarning yig‘indisi sifatida aniqlangan. Kodlaydigan (95%) va kodlanmaydigan ketmaketliklarni (90%) aniq chegarasi ko‘rsatib berildi. Olingan genom maydonlar uchun Fure tahlili qilingan (Stein and Bina, 1999) bo‘lib, unga ko‘ra tartibli tuzilishga ega nukleosomlarni keng joylari borligi aniqlangan. Spektrda yuqori cho‘qqisi borligi ko‘rsatilgan (360−400 aminokislota qoldig‘i). Bu nukleosomli DNKning ikiklamchi o‘lchami bilan bog‘liq. Fure qayta tuzilish usuli oqsillardagi davriylikni aniqlash uchun ham qo‘llanilgan. Aminokislotali ketma-ketliklarni [Orengo et al, 1997] SATN ma’lumotlar bazasi ham tahlil qilingan edi. TIM-barrel oqsillar guruhi misolida molekula tuzilishi bilan ketma-ketliklardagi davriy signallar o‘rtasidagi bog‘lanish tasdiqlangan. Bu esa Fure tahlili turli xildagi molekulyar genetik omillar bilan bog‘langan davriylikni aniqlashga yordam beradi.
Molekulyar biologiya fanining ilmiy-izlanishi aksariyat tarjriba-eksperiment asosida olib borilganligi uchun unda qo‘llaniladigan asosiy uslubiyot fizikaviy-kimyoviy o‘lchamlar asosida amalga oshadi. Mazkur sohada ko‘proq molekulyar tilga olinganligi sababli avvallambor fanda qabul qilingan molekulalarning o‘lchamlari(uzunligi, hajmlari, molekulyar massalari) haqida ayrim ma’lumotlarni eslatamiz. Atomlarning o‘lchami 10-10 metr(m) teng bo‘lib, bir millimetrning o‘n millionidan bir ulushga barobar, yoki 0.1 nanometr(nm) deb ham belgilanadi. Masalan S-S o‘rtasidagi kimyoviy bo‘g‘ning masofasi 1.54 A o ga teng. Biomolekulalardan qandlar yoki aminokislotalar o‘lchami yuqorida ko‘rsatgichdan bir necha barobar ortiq. Molekulalardan oqsillar esa bir necha o‘n marta o‘lchami ortiq ekanligi aniqlangan. Eritrotsitlardagi kislorod tashuvchi oqsil-gemoglabinning diametri 65A 0 . Viruslarning o‘lchami 100A 0 (10nm) dan 1000A 0 (100nm) gacha atrofida bo‘ladi. Hujayralapning o‘lchami molekulalarga nisbatan bir necha barobar ko‘p bo‘lib mikrometrlarda (bir mikron bir millimetrning mingdan biriga teng). Masalan, eritrotsitlarning eng uzun o‘lchami 7 mikrometr(mkm) yoki 7*104 ga teng. Biologik strukturalarning aksariyat qismi 1A 0 (0,1nm) dan to 104A o (1mkm) atrofida kuzatilgan. 2000 yili Britaniyalik olim Djon Salston va Amerikalik olim Kreygu Venterlar tomonidan birinchi bo‘lib odam genomining xaritasi yaratildi. Odamning genetik kodi 3,1 milliard ma’lum izchillikdan joylashgan nukleotiddan ibort bo‘lib, ular odam DNK molekulasini hosil qiladi, genetik kod DNKda nukleotid shaklida yozilgan. YUqorida qayd etilgan olimlar «Odam genomida» qaysi genlar inson hayotiga qanday ta’sir ko‘rsatishini, ya’ni uning sochining rangidan to yurak-qon tomir yoki rak kasalliklariga olib kelish mumkinligini aniqlashga kirishdilar. Tirik organizmning tarkibidagi molekulalarni fermentlar yordamida muayyan mahsulotlarga ma’lum muddat ichida aylantirib turadi. Fermentlar substratni mahsulotga parchalash yoki sintezlash vaqti millisekundlar (ms, 10-9 s-0,001 sek) orasida sodir bo‘ladi. Ayrim fermentlarning ish vaqti yanada tez bo‘lib, reaksiya tezligi mikrosekund(mks, 10-6 s) ichida amalga oshadi. Makromolekulalarning konfarmatsion o‘zgarishi ham juda tez vaqt ichida sodir bo‘ladi. Misol uchun, DNK molekulasining replikatsisi va ekspressiyasi uchun, ikkilamchi 69 strukturani ikkiga ajralish vaqti mikrosekundlarda sodir bo‘ladi. Oqsillardagi bir domenni ikkinchisiga nisbatan o‘z holatini o‘zgartirish uchun nonosekund (ns, 10-9 s) ichida bo‘ladi. Makromolekulalardagi nokovalent bog‘larning hosil bo‘lishi yoki uzilishi uchun nonosekund kerak bo‘ladi. Bundanda tez sodir bo‘ladigan jarayonlar lazer qurilmalarda qisqa yorug‘lik impul’slarini keltirsh mumkin. YOrug‘likning fotonlar tariqasida ko‘z orqali qabul qilinib, undagi yuz beradigan fizikaviy-kimyoviy jarayonlar va nerv orqali uzatilish vaqti pikosekund ichida yuz beradi(ps, 10-12s). Demak biologik jarayonlarning organizmda sodir bo‘lish muddatlari har xil vaqtlar ichida sodir bo‘ladi. Biologik tizimlarda sodir bo‘ladigan reaksiyalar qo‘ydagi chizmada ko‘rsatish mumkin. (vaqt sekundlarda belgilangan) Mikroskop yordamida biologiya fanida inqilobiy o‘zgarish bo‘lib o‘tgan. Tirik organizm hujayralardan tashkil topganligi va uning tarkibida organoidlar borligi, Mokrobiologiya va virusologiya fanlarining shakllanishi mikroskopning kashf qilinishi bilan boshlanadi. Mazkur asbobning taraqqiyoti oddiy mikroskopdan keyinchalik (1930) interferinsion so‘ng (1932) fazoviy-kontrast va ohiri (1939) elektron mikroskoplarning dunyoga kelishi bilan harakterlanadi. Elektron mikroskopda elektronlar oqimiga uchragan atom va molekulalar bilan to‘qnashib o‘z yo‘lidan og‘ishmasligi uchun, vakuum bo‘lishi kerak, elektronlar yoki magnit maydonlarni yordamida kuzatish ob’ektiga qarab o‘zgartirish mumkin. Elektron mikroskopda yorug‘lik mikroskopiga o‘xshash ikki nuqta orasidagi masofani kattalashtiradigan linzalar-ob’ektiv, okulyar, nurlarni yig‘uvchi kondensor bor, mazkur mikroskopda yorug‘lik linzalari o‘rniga magnit linzalar qo‘llanadi. Ular yordamida tezlashtirilgan elektronlar oqim kondensor orqali to‘qima yoki hujayraning maxsus tayyorlangan yupqa kesmasiga to‘g‘irlanib-fokuslanadi. Elektron mikroskopda qso‘llanadigan elektronlar oqimining to‘lqin uzunligi juda qisqa bo‘ladi, hozirgi kunda uning ko‘rish quvvati 2A 0 (0,0002 mkm) teng. Elektron mikroskopning kattalashtira olishi optik mikroskoplarnikidan bir necha barobar yuqori . SHu sababdan elektron mikroskop yordamida virus, bakteriyalarning strukturasi, hujayra organoidlari nukleoproteyn komplekslari(xromatin, ribasomalar , gen xromasomalari) va alohida oqsillarning makromolekulalari o‘rganilgan. Mazkur uslubiyotning yangi yo‘nalishlaridan-krioelektron mikroskop yordkamida ribasomalarning nozik strukturalari tadqiq qilinmoqda. Hujayra strukturasini uch o‘lchamli tasvirini olishda skanirlovchi elektron mikroskoplar ilmiy tadqiqot izlanishlarda tadbiq qilinishi hozirgi kunda juda ommalashgan. Molekulyar biologiya fanida keng qo‘llaniladigan fizikaviy asboblardan biri rentgenostruktur analiz hisoblanadi. Izotoplar (yunoncha), bir kimyoviy elementning har xil, atom massasi bilan farq qiladi. Izotoplarning atomlari yadrodagi neytronlar soni har xil protonlar soni bir xil bo‘ladi va elementlar davriy sistemasida bir o‘rinda turadi. Izotoplar barqaror (stabil) va barqaror bo‘lmaganlari mavjud. Biror makromolekula orqali rentgen nurlari (elektromagnit nurlanishning to‘lqin uzunligi 10-10m) o‘tganda ularni bir qismi atomlar atrofidagi elektronlar 70 tomonidan qaytariladi(diffraksiya) va ekranga yoki rentgen plyonkaga tushib molekula kristallini difraktogrammasini beradi. Bu suratda minglab turli tig‘izlikda nuqtali chiziqlar(reflekslar) ko‘riladi, ularni elektron hisoblash mashinalarida maxsus rejalar bo‘yicha hsoblanib olingan informatsiya asosida molekulaning fazodagi uch o‘lchamli tasviri chiziladi. Aynan shu usul orqali oqsillar, DNK va RNK larning asosiy strukturaviy ma’lumotlari olingan. Hozirgi kunda rentgen struktura analizi kamp’yuter texnologiyasi bilan birgalikda biomolekulalarning uch o‘lchamli fazoviy strukturali tadqiqot qilinmoqda. Molekulyar biologiya fanining metodologiyasida radioaktiv izotoplar ham etakchi o‘rinlarni egallaydi. Ushbu islubiyot orqali nuklein kislotalar, oqsillar, uglevodalr va bo‘lak makromolekulalarning kimyoviy struksturasi va almashinuvi avval ham o‘rganilgan va o‘rganilmoqda. Radioizotoplar stabil’ atom bo‘lmay balki. o‘z-o‘zidan yadrosi parchalanib zaryadlangan zarrachalar, elektronlar yoki gamma-nurlanishlar paydo bo‘ladi. Ularning muddatdan uzoq yillargacha davom etadi. Masalan fosfor R 32(14 sutka) uglerod atomi esa S 14 5570 yilga to‘g‘ri keladi. Elektronlarni aniqlash ssinsillsion yoki Geyger hisoblagich moslamalarida gazlarning ionlanishi bo‘yicha yoki radioavtografiya (sezgir fotoemul’sion qtlamlardagi kumushga ta’siri asosida) orqali aniqlanadi. Radiofaol molekulalar har xil kimyoviy jarayonlarda: modda almashinuvida, metobolitlardan molekulalarning sintezida, hujayralarda moddaldarning joylanishini, funksiyalari va vazifalari aniqlanishi mumkin. Agar hujayrani RNK uchun zarur bo‘lgan nishonlangan nuleozid orqali inkubatsiya qilinsa RNK ning yadroda sintezlanishi so‘ng sitoplazmaga kuchirilishini kuzatish mumkin. O‘rganilayotgan molekulaga radioaktivlikni ferment orqali ham kirgizish mumkin. Masalan fosfotransferaza va nukleotidiltransferazalar orqali nishonlangan atomlarni oqsil, uglevod va nuklein kislotalarga yuborish mumkin. Mazkur jarayonlarda har xil shakllardagi radioaktiv ATF lar (ATF S 14 , ATF-2,8 N3, ATF-R32) foydalaniladi. Modda almashinuvida molekulalarning sedimentatsiya analizi va ularning massalarini aniqlashda ul’tratsentrifugirlash molekulyar biologiyada keng qo‘llaniladi. Mazkurmetod 1926 yil shved olimi Svedberg tomonoidan kashf qilingan. Ul’tratsentrifugalarning aylanish tezligi bir minutda 75000 ga etadi. Bu qiymatni markazdan qochish kuchiga solishtirsak alanayotgan molekulaning erga tortish kuchi (d) 400 000 ga teng bo‘ladi. Mana shunday katta kuch ta’sirida molekula yoki zarrachani chukishi sedimentatsiya deyiladi. Hujayra kompanentlarini, zarracha yoki molekulalarni ul’tratsentrifugalashda cho‘kishi tezligi sedimentatsiya koeffitsenti deb atalib, S harfi bilan yoziladi. 1S juda kichik o‘lcham bo‘lib u vaqt o‘lchovidan (sekunlarda) belgilanadi, ya’ni 1*10-13 s ga teng. Unga to‘g‘ri keladigan markazdan qochish kuchi dx/dt*1/w2 x bo‘lib, bunda w-rator aylanio‘ining burchak tezligi va x-rotor markazidan eritma solingan probirkaning o‘rtasigacha bo‘lagn masofa. 71 Gemoglabin molekulasining sedimentatsiya koeffitsenti 4.5S, T-RNK molekulasi-4S, lizosomaniki esa 9400S ga teng. Tekshirilayotgan molekula, subhujayra kompanenti qancha zich va og‘ir bo‘lsa, uning sudimentatsiya koeffitsenti ham shuncha katta bo‘ladi. Har xil zichlikdagi xlorli seziya ishtirokida ul’tratsentrifugirlash uslubi yordamida DNK ning polukonservativ yo‘li orqali replikatsiyasi aniqlangan. Ul’tratsentrifugirlash orqali makrlmolekulalar, hujayra organoidlarini ajratish , molekulyar massalari va sedimentatsiya koeffitsentlarianiqlanadi. Xromatografiya usul eritmadagi modda molekulalarini ikkita: biri harakatsiz (turg‘un), ikkinchisi shu statsionar qavat orqali fil’tirlanib o‘tadigan harakatchan oqim (elyuent) shaklidagi fazalar bo‘yicha bo‘linish asosida ajratadigan fizikaviy-kimyoviy sulga aytiladi. Bu usul 1906 yil rus olimi M.Svet tomonidan kashf etilgan. U birinchi bo‘lib turli birikmalarni adsorbilovchi material bo‘r kukuni to‘ldirilgan ustun (kolonka) da turlicha yutilishi asosida xlorofill va boshqa o‘simlik pigmentlarini ajratishga muvfffaq bo‘lgan. Tekshirilayotgan moddalr kolonkada rangli halqalar shaklida ajralganidan Svet bu usulni xromatografiya (yunoncha xroma-bo‘yoq, grafoyozaman) deb atagan. Hozirgi kunda xromatografiyaning birinchi variantlari mavjud bo‘lib, imolekula yoki makromolekulalarning zaryadiga qarab matrikslarning har xil turlari ishlatiladi, ularni ionalmashinuvchi xromatografiya molekulalarining o‘lchamiga asoslangan gel’-xromatografiya yoki gel’-fil’tratsiya deb ataluvchi xillari mavjud. Xromatografiya usullari ichida samaradorligi yuqori bo‘lgan asffin xromatografiya (tekshirilayotgan modda yoki molekulaning turg‘un tutuvchi-ligandlar bilan o‘zaro munosabatlariga asoslangan) hisoblanadi. Misol uchun, bog‘langan ferment*substrat kompleksini maxsus ligandalr olingan kolonka orqali o‘tkazilsa ferment ligand bilan bog‘lanib, bo‘lak ballast modda yuvilib ligandda faqat kimyoviy bog‘lanib qolshan gomogen ferment-oqsilni elyuirlash mumkin. Aynan shu uchsul orqali maxsus antitelalarni xromasomadagi DNK bo‘lakchalariga bog‘lab toza holda ajratish mumkin. Hozirgi kunda keng qo‘llaniladigan usllardan yana biri suyuqlik(jidkosnaya). Xromatografiya hisoblanadi. Xromatografiya kolonkasi kremniyorganik tabiatli smola solinib, muxit gomogen mikroster bo‘lib ular bosim ostida analiz qilinuvchi molekulalar tez va toza holda fraksiyalarga ajraladi. Molekulyar biologiyada qo‘llaniladigan fizikaviy usullardan yana biri elektroforez hisoblanadi. Elektroforez usullari bilan oqsillarni ajratish, oqsil zarrachalarining elektr maydondagi harakatchanligini belgilashga asoslangan. Oqsillar molekulasida ko‘p-NH+ 3 SOOguruhlar mavjud bo‘lganidan ular manfiy va musbat zarrachalar, bo‘lib elektr maydonida siljishi tezligi molekulaning zaryadiga, shakli va o‘lchamiga bog‘liq. Elektroforezni suvli (buferli) muhitda g‘ovakli polimer tutuvchi : kraxmalli, agarli yoki poliakrilamid gelida sellyulozali va introtsellyulozali plastinkalarda olib boriladi. Odam gemoglabinini tripsin oqsili bilan 72 parchalangan fragmentlarni sellyulozali plastinkalarda elektroforez qilinib peptidli xaritalar- “fingerprintlar” (barmoq izlari) tuzilgan. Xuddi shu usul asosida yarimo‘roqsimon anemiya kasalligi gemoglabinning ß-zanjirida bitta aminokislotaning o‘rni almashib qolganligi aniqlangan. Keyingi yillarda oqsillarni poliakrilamid geli (PAAG) da elektroforez olib borish uchun keng qo‘llanilmoqda . Bu usulda oqsillarni tekshirish uchun bufer bilan xullangan lenta ko‘rinishidagi fil’tr qog‘oziga yoki gel’ chetiga nuqta yoki chiziq holida bir nechta tomchi oqsil eritmasi tomizilib, qog‘ozning uchlari eletrogdlar o‘rnatilagan bufer ertmaga botirib qo‘yiladi. Elektrodlar oqsilli turg‘un elektr oqimi yuborilganda paydo bo‘lgan elektr maydonini kuchi ta’sirida tomizilgan oqsillar zaryadining miqdori va belgisiga qarab anod yoki katod tomonga bir necha santimetr siljiydi. Bufer bilan namlangan fil’tor qog‘ozida yoki gellarda shunday elektroforetik muhit paydo bo‘ladiki, ularda oqillarning zaryadi hamda molekulalarning hajmi bo‘yicha harakat qiladi, jumladan, gellar molekulyar elektr sifatida ham xizmat qiladi. Elektroforetik usulda qatoriga izotaxoforez va izoelektrofokusirlash ham taalluqlidir. Izotaxoforezda ionlar avval o‘zlarining zaryadlari va harakatchanliklariga qarab taqsimlanadi. Izoelektrofokusirlash usuli oqsillarni bir vaqtda kuchlanish gradientida hamda rN ga qarab ajratish imkonini beradi. Hujayrani alohida o‘stirish usuli ham biologiyada jumladan, molekulyar biologiyada keng qo‘llanilmoqda. Ushbu uslub 1885 yildan boshlangan bo‘lib,tovuq embrionining hujayralari tuzli eritmalarda uzoq muddat davomida tirik holatda aniqlangan. 1907 yildan esa to‘qimalarning ma’lum qismlarini ilmiy- tadqiqot ishlarida foydalana boshlagan. Hozirgi kunda dissotsiirlanib o‘stirilgan hujayradan ko‘p miqdorda bir xil hujayralarni ko‘paytirish mumkin. Ba’zi paytlarda o‘stirilayotgan hujayraladan mutantlari ham paydo bo‘lib, ular to‘xtovsiz ko‘payish xususiyatiga ega bo‘ladilar. Ular rak hujayralriga o‘xshash to‘xtovsiz bo‘linishga, ulr yana bir predmedning ustida yaxshi o‘sish xususiyatiga ega. Bir xildagi o‘stirilgan hujayralarini uzoq muddatga-700S saqlanib, bu davrda ular proliferatsiya (YAngitdan bo‘lishi, ko‘payish) xususiyatlarini yo‘qotmaydilar. Kalamushlar va olmaxonlarning (xomyak kemiruvchi hayvon) fibroblastli va odamning epiteial hujayralari laboratoriya sharoitida ko‘paytirilib ilmiy ishlarda foydalanadi. Bir xil hujayralarni laboratoriya sharoitida o‘stirishda klonlash usulidan ham keng foydalaniladi. Boshlanishi bitta hujayradan bo‘linib ko‘paygan hujayralarning populyasiyasiga klon deyiladi. Klonlash yo‘li orqali mutatsiyaga uchragan muayyan genlarning hujayralari ayrim oqsillar uchun defektli bo‘ladi. Aynan shu uslub asosda oqsillarning normal hujayralardagi rolini aniqlash mumkin. Ikki xil hujayraning qo‘shilishidan ikki yadroli geterokarion hujayrani olish mumkin. Mitotik bo‘linishidan so‘ng geterokarion gibrid hujayraga aylanib, hamma xromasomalar yadroga birlashadi. Bunday gibridli hujayralar orqali xromasomalarning alohida funksiyalari, 73 hujayra tarkibidagi organoidlarning o‘zaro ta’sirlarini, normal hujayra bilan qiyosiy ravishda tadqiqot ishlari olib boriladi. Ma’lumki gibridli hujayralar turg‘un bo‘lmaydi. Jumladan, gibridli hujayra odam-sichqon ma’lum vaqtdan keyin insoniy xromasomaning faoliyati yo‘qoladi shu asosda xromasomalarning ayrim funksiyalarini aniqlanib, aynan shu metodologiya genetik xaritalarni tuzish imkonini beradi. Molekulyar jarayonlarni o‘rganishda hujayrasiz tizimlar (sistemalar) alohida o‘rin egallaydi. Bu tizim qo‘shimcha reaksiyalardan holi bo‘ladi. O‘tgan asrning o‘rtalarida (1954) P. Zamechnik oqsil sintezining translyasiyasida hujayrasiz sistemadan birnchi bo‘lib foydalangan. Oqsil sintezining transkripsiya, translyasiya jarayonlarining ayrim detallarini o‘rganishda rus olimi akademik A.S.Spirin samarali foydalangan. Hujayra ekstraktidan oqsil sintezlochi komponentlarni (i-RNK, ribosomalar,t-RNK va bshqalar) ajratib, so‘ngra ularni alohida-alohida sistemaga kirgizib funksiyalarini oldinma-ketin aniqlaganlar. Hujayrasiz sistema tufayli genetik kod dunyoga ma’lum bo‘ldi. Bujarayonda i-RNK o‘rnida tarkibi ma’lum bo‘lgan sintetik oligo va polenukleotidlar foydalanilgan. Hujayrasiz sistema tufayli DNK-ning replikatsiya va transkripsiyasi, RNK ning splaysingi fanga ma’lm bo‘ldi. Molekulyar biolgiyada hozirgi kunda keng qo‘llanilayotgan uslublardan yana biri monoklonal’ natitela (antitana) bo‘lib, ular murakkab eritmalari molekulalarni aniqlashda (identifikatsiya qilishda) nozik va sezgir biokimyoviy metodologiya hisoblanadi. Umuman olganda antitanalar umurtqali hayvonlarda begona birikmalarga qarshi kurashadigan oqsillar (immunoglobulinlar). Umurtqali hayvonlarning hujayralari har xil shakllardagi ko‘p miqdordagi antitanalar ishlab chiqarishga qodir bo‘lib, ular o‘ta saralanib har qanday molekulalarni izlab topish, unga ta’sir qilish xususiyatiga ega. 1976 yilda ß-limfotsitlarni klonlash orqali faqat maxsus bir xildagi antitanalarni ko‘p miqdorda sintezlash usuli ishlab chiqilgan. Lekin ßlimfotsitlarning hayotchanligi uzoq bo‘lmaganligi uchun bunday hujayralani tez bo‘linib, ko‘payadigan rakli hujayralarga qo‘shilib, bunday hujayralani gibridomalar deyiladi. Ulardan esa keyinchalik monoklonal antitanalar olingan. Monoklonal’ antitanalarda absalyut, maxsus spetsifik oqsillarga ta’sir qilishi bilan harakterlanadi. Kelgusida monoklonal’ antitanalar tufayli yangi guruhlar katalitik faol molekulalar abzimlarni sintezlash mumkin.