­Ўзбекистон республикаси соғЛИҚни сақлаш вазирлиги тошкент педиатрия тиббиёт институти

ҚОНДА АЛАНИНАМИНОТТРНАСФЕРАЗА ФАОЛЛИГИНИ
КИНЕТИК УСУЛДА АНИҚЛАШ

Аланинаминотрансфераза (АлАТ) фаоллигини аниқлаш усули ушбу фермент катализаторлигида L–аланинни пируватга айланишига асосланган бўлиб, уни лактатдегидрогеназа (ЛДГ) ёрдамида қайтарилиши жараёнида НАД∙Н ни сарфланиши содир бўлади:

АлАТ
1 ) 2-оксоглутарат + L – аланин L-глутамат + Пируват;

ЛДГ
2 ) Пируват + НАД ∙ Н + Н ⁺ L-лактат + НАД⁺.

Эритманинг оптик зичлигини ультрабинафша нур соҳасида камайиши тарзида акс этувчи НАД∙Н концентрациясининг камайиши, АлАТ фаоллигига пропорционалдир.

Намуна таркибидаги эндоген пируват инкубацияни бошланиш даврида («лаг-даври») реагентда мавжуд бўлган ЛДГ ферменти таъсирида тез ва тўлиқ қайтариладики, бу ташхис натижаларига таъсир этмайди.


Текширилувчи модда: қон зардоби.
Аппаратлар: спектрофотометр, термостат, центрифуга, холодильник, қалинлиги 1 см ли кюветалар, 100 мл ҳажмли колбалар, 5 ва 10 мл ли пипеткалар, 0,1 мл ли микропипеткалар.


Керакли реактивлар

1. 
   Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄).
   
2. 
   Калий гидрофосфат (К₂НРО₄ ∙ 3Н₂О).
   
3. 
   Фосфатли буфер, 0,1 мол/л; рН = 7,4: 0,16 гр калий гидрофосфат ва 2,07 гр калий гидрофосфат 3 мол сувли тузидан олиб 40-60 мл сувда эритилади, рН ини текшириб, 100 мл ли ўлчов колбаси сув билан тўлдирилади. Музлатгичда сақлаш керак.
   
4. 
   L-альфа-аланин.
   
5. 
   Субстратли буфер эритма, 0,1 мол/л ли фосфатли буферда 0,63 мол/л L- аланин бўлган эритма. рН = 7,4; 5,62 гр L- аланин 80 мл 0,1 мол/л ли фосфатли буфер эритмасида эритилади, уни рН и текширилиб, 100 мл колбани сув билан тўлдирилади. Музлатгичда сақланганда 2 ой давомида рН доимийлиги сақланади.
   
6. 
   Қайтарилган β-никотинамидадениннуклеотид, иккинатрийли тузи, 15 мол/л (моляр экстинкция коэффициенти 340 нм да 5,6 ∙ 10² м² ∙ моль^-1 дан кам эмас): 16 мг НАДН ∙ Na₂ 4H₂O 1,5 мл сувда эритилади. Эритмани қора идишда, музлатгичда 2 хафта сақлаш мумкин.
   
7. 
   Ўювчи натрий (NaOH), 5 мол/л.
   
8. 
   α-кетоглутар кислота, 0,56 моль/л: 0,245 гр α-кетоглутар кислотаси 2,5 мл сувда эритилади, унга 0,5 мл 5 моль/л натрий ишқор эритмаси қўшилади. Агар α-кетоглутар кислотасини иккинатрийли тузи ишлатилса, унда 0,318 гр туз 3 мл сувда эритилади. Эритма музлатгичда сақланса 2 хафта давомида барқарор бўлади.
   
9. 
   Қуён ва чўчқа скелет мускулидан олинган лактодегидрогеназанинг 50% глицеринли суспензияси. Специфик каталитик фаоллиги 8 ммоль/(с ∙ л) дан юқори. Аралашмада: АсАТ < 0,01%, ГлДГ <0,003 %, АлАТ < 0,01 %. Ишчи эритмани тайёрлаш учун 45 мкл суспензияга 5 мл сув қўшилади. Эритмани музлатгичда сақланганда 3 ойгача турғун бўлади.
   
10. 
    Натрий хлорид, 154 ммоль/л (физиологик эритма). Ҳамма реактивларни бидистилят сувда тайёрлаш керак.