­Ўзбекистон республикаси соғЛИҚни сақлаш вазирлиги тошкент педиатрия тиббиёт институти

Биоматериалларни олиш. Шприц ёрдамида қуруқ центрифуга пробиркасига 2,0-3,0 мл қон венадан олинади. Қон 10 дақиқага қолдирилади, сўнгра эҳтиётлик билан игна ёрдамида пробирка деворларидан ажратилади. 1500 айл/мин билан 10 минут центрифугаланади. Қон зардоби алоҳида пробиркага олинади. Зардобни музлатилган ҳолатда 1 ой сақлаш мумкин. Ташхис учун 0,5 мл зардоб ишлатилади.


Ишни бориши тартиби. АлАТ фаоллигини аниқлаш учун иккита пробирка оламиз: №1 – тажриба, №2 – назорат. Тажриба ва назорат пробиркаларига 3 мл дан субстратли – буфер эритмасидан, 0,05 мл дан НАДН эритмасидан ва 0,1 мл дан ЛДГ суспензиясидан солинади. Тажриба пробиркасига 0,5 мл қон зардоби, назорат пробиркасига 0,05 мл 154 ммол/л NaCl эритмасидан қўшилади. Пробиркадаги эритмалар аралаштирилади ва 37⁰С ли термостатга 10 дақиқага қўйилади. Сўнгра №1 ва №2 пробиркаларга 0,1 мл дан α-кетоглутар кислота эритмасидан қўшилади ва аниқ кўрсатилган вақт оралиғида (1, 2 ва 3 дақиқа), спектрофотометр ёрдамида тажриба ва назорат пробиркалари экстинкцияси сувга нисбатан 340 нм тўлқин узунлигида қалинлиги 1 см бўлган кюветада ўлчанади. Эритма ва зардоб ҳароратини аниқлашдан олдин, уларни бир хил ҳароратга етказиш керак. Тажрибадан олдин миқдорий нисбатлари 60 : 1 : 1 бўлган “субстрат-буфер, НАДН эритмаси ва ЛДГ” реактивлар аралашмасини тайёрлаш мумкин. Аниқлаш қуйидаги схема бўйича амалга оширилади (жадвал)


АлАТ фаоллигини аниқлаш

Реактивлар	Тажриба намуна, мл	Назорат намуна, мл	Намунадаги моддани охирги концентрацияси
Субстратли-буфер эритма	3,0	3,0	Фосфатли буфер, 80 ммоль/л
НАДН-эритма	0,05	0,05	500 ммоль/л
ЛДГ	0,1	0,1	0,18 ммоль/л
Қон зардоби	0,5	-	20 000 нмоль/(с ∙ л)
154 ммоль/л ли NaCl эритмаси	-	0,05
Аралаштирилиб 30 ёки 37 ^0С да 10 минут ушлаб турилади
α-кетоглутар кислота эритмаси	0,1	0,1	15 ммоль/л

Инкубациядан сўнг 60 сония (лаг-фаза) ўтгач, экстинкция ўлчанади ва секундомер ишга туширилади. Аниқ вақт оралиқларида (1, 2 ва 3 дақиқаларда) экстинкция ўлчанади (ёки қисқароқ, лекин бир хил оралиқ вақтларда).

Тажриба ва назорат намуналари сувга нисбатан 340 нм да 1 см қалинликдаги кюветада ўлчанади.