Фармамакологик биокимё

Машғулот N37. +он зардобида гистидаза фаоллигини Табор ва Мелер
услубини В.А.Буробин модификациясида ани=лаш.
Гистидаза органоспецифик ферментлардан былиб, инсон жигари ва терисида
ми=дори кыпро = учрайди ва жигар касаллигида =он таркибида ошиши
кузатилади. Со\лом одам =он зардобида жуда оз ми=дорда былиб , асосан
жигар хасталигида кыпайиб, касаллик даражасини белгилайди.
Услубнинг асосида гистидаза таьсирида гистидиннинг дезаминланишидан
хосил былган уроканин кислотасини ми=дорини ылчаш былиб , унинг
кислотали мухитдаги 264нм нур ютиш экстинкцияси фермент фаоллигини
белгилайди.
Реактивлар.
1.
L-гистидин моногидрохлорид, 0,2м эритма (418мг 100мл да ), 1м ли натрий
гидроксид билан рН-8,2 га етказилади.
2.
пирофосфатли буфер, 0,1м эритма рН-8,2, 4,46г натрий пирофосфатни
200мл ли ылчамли колбада тахминан 100мл сувда эритилиб, 0,1м хлорид
кислота эритмаси билан рН-8,2 етказилади ва белгигача дистилланган сув
=уйилади
3.
учхлорсирка кислотаси (УХСК) 20%ли эритма
4.
таркибида глутатион ва альбумин са=лаган фаоллаштирувчи эритма хажми
100мл былган ылчов колбасига 155мг =айтарилган глутатион ва 400мг

---

кристаллнган альбумин солиниб, уларни 50мл дистилланган сувда
эритилади ва 1м натрий гидроксид ёрдамида рН-8,2 етказилади, сынгра
белгисигача сув тылдирилади.
5.
0,001м уроканин кислотаси эритмаси - калибрлаш графиги тузиш учун
(8,7мг уроканин дигидрат кислотасини 50мл ли ылчов колбасида 0,001м
натрий гидроксид эритмасида эритилади.)
Жихозлар.
Пробиркали штатив, 1ва 5мл хажмдаги пипеткалар, лаборатория
термометрли сув хаммоми, термостат 37
0
С ли, центрифуга тарозиси билан,
СФ.
Материал. =он зардоби
Ишнинг бажарилиши.
Ферментатив реакция =уйдагича кечади.
Иккита пробирка олиниб (назорат ва тажриба намуналари) , щар бирига
0,3мл дан пирофосфат буфери, 0,5мл дан текширилувчи =он зардоби ва 1мл
дан фаоллаштирувчи эритма =ышилади. Тажриба пробиркасига 1мл
гистидин эритмасидан =уйиб, намуна хажмининг дистилланган сув билан
3мл га етказилади. Пробирка таркиби чай=атилиб , аралаштирилади. Иккала
пробирка 2 соатга 37
0
сув хаммомида ёки термостатда са=лангандан сынг ,
устига 1мл дан учхлорсирка кислотаси =уйилади. Шундан сынг назорат
намунаси тутган пробиркага фаоллаштирувчи эритмадан 1мл =ышилиб,
умумий хажми дистилланган сув билан 3мл етказилади ва чай=атилиб ,
аралаштирилади. Намуналар 5 минут 3000 айланиш 
тезлигида
центрифугаланиб, чыкма усти сую=лиги тоза пробиркаларга олинади .
Текширилувчи намунани экстинкцияси назоратга нисбатан 264нм да
спектрофотометрда =алинлик =авати 1см былган кюветада ылчанади.
Калибрловчи график тузиш учун еттита номерланган пробирка олиниб,
=
уйидаги жадвалда кырсатилган ми=
дорда компонентлар солинади
.
Ураканин кислоатсининг ишчи эритмасини тайёрлаш унинг бошлан\ия
0,001м эритмаси олиниб, дистилланган сув билан 10 маротаба суюлтирилади.
Уроканин
кислотасининг
ишчи
эритмаси, мл
пирофосфат
буфери, мл
фаоллашти-
рувчи
эритма, мл
гистидин
эритмаси,
мл
уроканин
кислотасининг
намунадаги
ми=дори,
мкмоль
1 0
0,3
1,0
1,0
0
2 0,05
0,3
1,0
1,0
0,005
3 0,10
0,3
1,0
1,0
0,010

---

 4 0,15
0,3
1,0
1,0
0,015
5 0,20
0,3
1,0
1,0
0,020
6 0,30
0,3
1,0
1,0
0,030
7 0,40
0,3
1,0
1,0
0,040
Щамма пробиркалардаги намуналар хажми дистилланган сув билан 3мл га
етказилиб, устига 1мл дан учхлорсирка кислотаси =уйилади ва
аралаштирилади. 3000 айланиш тезлигида 5 минут центрифугалаб, чыкма
усти сую=лиги тоза пробиркаларга олинади ва экстинкцияси ю=орида
кырсатилгани каби ылчанади.
Щисоблаш формула быйича бажарилади.
Х=
Е
· 200
2
бунда Х-=он зардобидаги гистидаза фаоллиги
мкмоль/соат -л, Е-калибрлаш графиги быйича топилган уроканин
кислотасининг ми=дори , мкмоль, 200-1л =он зардобига хисобланган
коэффицент, 2- 1 соатга хисобланган коэффицент