Kirish I bob. Oqsil strukturalarini va uning modellari

1.2. Oqsil strukturalarining turlari va tasniflari
Bu kabi sodda misollar yordamida funksional proteomikani to‘liq tavsiflab bo‘lmaydi. Organizmda oqsil va boshqa moddalarning o‘zoro ta'sirlanish tarmog‘i to‘g‘risidagi tushunchalarni yaratish katta mexnat kuchi va barcha zamonaviy bioinformasion vositalarni jalb etishni talab qiladi. Bu kabi tushunchalarni yaratish ustida ishlar boshlangan va yildan yilga boyitib borilmoqda.
Karbon kislotalar metabolizmi haritasining umumiy konturlariKarbon kislotalar metabolizmi xaritasining yaralishi bu soxada qo‘lga kiritilgan dastlabki yutuqlardan biri sanaladi. U Rossiya fanlar akademiyasi qoshidagi A.N. Bax nomidagi biokimyo institutida yaratilgan. Bu xarita doimiy davriy tuzilishdagi reaksiyalar tarmog‘ini namoyon etadi. Xaritada vertikal bo‘ylab bir xil sondagi uglerod atomlarini (1dan 10 tagacha) tutuvchi birikmalar, gorizontal chiziqda esa funksional analogik metabolitlarni namoyon etadi. Xaritadagi kimyoviy strukturalar ko‘plab ko‘rsatmaga ega strelkalar (mos kinyoviy jarayonlarda ishtirok etuvchi fermentlar(oqsillar)) bilan bog‘langan. Buni D.I.Mendeleevning davriy sistemasiga qiyoslasa bo‘ladi. Mendeleev davriy sistemasi singari mazkur xarita bashorat qilish kuchiga ega. Uni yordami bilan bir qator yangi fermentlar bashorat qilingan, keyinchalik esa ushbu fermentlar tadqiqotlar natijasida kashf qilingan. Bu kabi sxemalar boshqa metabolitik yo‘llar (uglevod, aminokislota), biokimyoviy reaksiyalarining metabolitlari uchun ham tarqalishi mumkin.
Amaliy proteomika. Bitta organizmdagi barcha oqsil va peptidlarning o‘zoro ta'sir mexanizmlarini aniqlash proteomikaning asosiy vazifalaridan biri hisoblanadi. Bu kabi amaliy ishlardan ijobiy natijalarni qo‘lga kiritishdan farmakologiya va tibbiyot xodimlari manfaatdordirlar. Chunki, insondagi patologik holatlarning yuzaga chiqishi organizmdagi ba'zi oqsillar tarkibi o‘zgarishi bilan birga kechadi. Shuning uchun proteomika soxasida qo‘lga kiritilgan yutuqlar yangi dori vositalarini ishlab chiqish va ko‘p asrlar davomida davosi topilmay kelayotgan kasalliklarni davolash usullarini ishlab chiqishda qo‘llanib kelinmoqda. Bugungi kunda qo‘llanilayotgan dori vositalarining 95% oqsil moddalariga ta'sir etadi. Proteomika tizimli yondashuv orqali yangi oqsillarni paydo bo‘lishini identifikasiyalash va zarurlik darajasini effektiv baholash va shunga bog‘liq ravishda yangi diagnostik va terepevtik vositalarni ishlab chiqish tezligini oshirishi mumkin.
Proteomga bog‘liq bo‘lgan izlanishlar proteomika fanining paydo bo‘lishidan oldin, XX asrda insulinning qandli diabet kasalligini davolashdagi o‘rni kashf qilingan davrdayoq boshlangan edi. Insulin preparatlarining yaratilishi esa millionlab insonlarning xayotini saqlab qolgan.
Xozirgi kunda proteomika genomika va bioinformatika bilan birga yangi dori vositalarini ishlab chiqishga e'tibor qaratmoqda. Bunda oqsil moddalari molekulyar nishon vazifasini bajaradi. Dori vositalarining ta'siri uchun yangi nishonlarni topish bioinformatika usullari yordamida xal etiladi, bunda genom tahlil ob'ekti bo‘lib sanaladi.
Ammo, genom tahlilidan keyin mazkur oqsil intensiv ekspressiyalanishi va hujayrada ish qobiliyatini saqlashi xaqida isbotlarga ega bo‘lish kerak. Bu masalani proteomika xal etadi. Shu tariqa dori vositasi uchun molekulyar genetik nishon aniqlanadi.
Proteomika o‘zi mustaqil ravishda nishonlarni izlash muammosini xal qilishi mumkin. Agar normal va potologik to‘qimaning proteom xaritalariga ega bo‘lsak, ular orasidagi farqqa asoslanib, u yoki bu patologik xolatni rivojlanishida qaysi oqsil axamiyatga ega ekanligi hususida tushunchaga ega bo‘lish va ulardan nishon sifatida foydalanish yoki bu bilimlarni diagnostikada qo‘llash mumkin bo‘ladi. Kelajakda oddiy qon analizi qatoriga qonning proteom haritalarini tuzish ham qo‘shilishi mumkin. Buning uchun poliklinikalarda davolanuvchilardan davriy ravishda qon olib turishga yordam beradigan maxsus qurilmalarni qo‘llash talab etiladi. Kasallik holati yuzaga kelganida esa bemorning proteome haritasi uning sog‘lom vaqtdagi proteom haritasi bilan solishtirish kerak bo‘ladi va qonning oqsil tarkibida yuzaga kelgan o‘zgarishlar va kasallik sababini aniqlash mumkin bo‘ladi. O‘sma va normal hujayralar, ma'lum bir faktorlar (fizik, kimyoviy) ta'siridan keyin hujayralarning holatini batafsil taqqoslash, diagnostika maqsadida biologic suyuqliklardan foydalanish –bularning barchasi katta qiziqish uyg‘otadi va tibbiyot, veterenariya, farmakologiya, oziq-ovqat sanoati kabi soxalarda yangi istiqbollarni ochadi. Buning uchun ulkan va qiziqarli ishlarni amalga oshirish kerak bo‘ladi.
Shuning uchun, oqsillar tanani saqlash uchun juda muhim bo'lganligi sababli, strukturani bashorat qilish uchun boshqa sabablar bormi?
Boshimning tepasida joylashgan protein tuzilishi oqsillarning o'zaro ta'sirini aniqlash uchun juda muhim, masalan, molekulyar yo'llar yoki virusli kapsid tuzilmalarini aniqlash. Proteinning tuzilishini bilish olimlarga uning nima va qanday ishlashini yaxshiroq tushunishga yordam beradi. Protein tuzilmalariga qarab, olimlar gen uchun boshqa allel biokimyoviy darajada organizmning fenotipida qanday o'zgarishlarga olib kelishini aniq aniqlashlari mumkin. Protein tarkibidagi fermentativ funktsiyaga ega bo'lgan joylarni bashorat qilish olimlarga turli omillar uning funktsiyasiga qanday ta'sir qilishini taxmin qilish imkonini beradi. Harorat yoki pH o'rtasidagi farqlar oqsil tuzilishiga ham ta'sir qilishi mumkin va oqsillarning pH yoki harorat o'zgarishiga qarab qanday o'zgarishini tushunish olimlarga oqsilning o'ziga xos muhitda qanday ishlashini aniqlashga yordam beradi.
Savolingizga aniq dori dizayni kontekstida javob berish uchun: agar biz dori dizayni uchun protein tuzilishini bashorat qilishga tayansak, albatta yaxshi bo'lar edi, ammo tuzilmani bashorat qilish hali ham to'liq aniq emas. Dori-darmonlarni loyihalash loyihalari qimmat, shuning uchun birinchi navbatda pulni eksperimental tuzilmani aniqlashga sarflash oqilona bo'ladi, chunki u tuzilishga asoslangan dori dizayni uchun yanada ishonchli asosni ta'minlaydi (muqobil variant pulni loyihalashda muvaffaqiyatsiz urinishlarga sarflash bo'ladi) yaxshi dori, chunki bu urinishlar noto'g'ri bashorat qilingan tuzilma bilan boshqariladi).
Bundan tashqari, eksperimental tuzilmani aniqlash bashorat qilish uchun qimmatlidir, chunki u homologiyani modellashtirish uchun ma'lum tuzilmalar kutubxonasini oshiradi.
oqsil tuzilishini bashorat qilish hali boshlang'ich bosqichida, shuning uchun misollar yo'q, foyda juda katta, ammo oqsillar tuzilishi = funktsiyasi va siz aytganingizdek, oqsillar tanadagi deyarli hamma narsani katalizlaydi yoki hosil qiladi. Biz tuzilmani ishonchsiz tarzda bilib olamiz, ammo strukturani bashorat qilish bizga buyurtma berish uchun oqsillarni yaratishga imkon beradi, chunki strukturani ketma-ketlikda bashorat qilish ko'p jihatdan zamonaviy biologiyaning muqaddas qismi bo'lgan oqsillarning katlanishini bashorat qilishni anglatadi. Buni ishonchli va murakkabroq oqsillar bilan bajara olish, buni bajaradigan odamga qoqilib ketishga umid qilish o'rniga, uni nusxalash uchun maxsus vazifalarni bajarish uchun oqsillarni yaratishga
imkon beradi.
SARS-CoV-2 nsp3 tuzilishini bashorat qilish uchun ansambl ish oqimi. Strukturani bashorat qilishning alohida protokollari o'z-o'zidan tartibsiz hududlar (IDR), transmembran mintaqalar (TM), signal peptidlari va shablonlarning holati haqidagi ma'lumotlardan foydalangan holda har bir protein ketma-ketligini sinchkovlik bilan tahlil qilish orqali aniqlanadi.
Bugungi kunga kelib, SARS-CoV-2 dan beshta oqsilning qisman yoki to'liq tuzilishi eksperimental ravishda hal qilindi. SARS-CoV-2 ning molekulyar mexanizmini tushunishning dolzarbligini hisobga olib, biz barcha hal qilinmagan strukturaviy va etuk strukturaviy bo'lmagan virusli oqsillarning strukturaviy modellarini yaratish uchun ansambl ish oqimidan foydalandik. Murakkabligi bo'yicha o'zgarib turadigan oqsil tuzilishini bashorat qilish usullarining ishlashi tufayli oqsillar ketma-ketligi oqsil tuzilishini bashorat qilishning zamonaviy usullari kombinatsiyasini optimallashtirish uchun diqqat bilan tahlil qilindi. Shunday qilib, natijada olingan modellar har bir oqsilning umumiy shakli bo'yicha maksimal aniqlik va maksimal ma'lumotga ega. Bu yerda biz 27 ta etuk virus oqsilining har biri uchun konspekt, ularning strukturaviy modellari va SARS-CoV-1ga nisbatan o’zgaruvchanlik va SARS-CoV-2 ga potentsial funktsional ahamiyati kabi qo’shimcha muhim ma’lumotlarni taqdim etamiz.
Har bir ketma-ketlikdan ikkita asosiy omildan iborat bo'lgan profil asosida alohida protokollar yaratildi:
Birlamchi ketma-ketlikka asoslangan ma'lumotlar. Konservalangan domenlardagi qoldiqlar (Pfam (Finn va boshq. 2014)) va ichki tartibsiz hududlar IuPred2
(Mészáros, Erdos, and Dosztányi 2018) yordamida aniqlandi, bu aminokislotalar segmentlarining tarkibiga va ularning barqaror strukturaviy motivlarni shakllantirish tendentsiyasiga tayanadi. TMHMM (Krogh va boshq. 2001) yashirin Markov modeliga asoslangan spiral transmembran oqsil hududlarini bashorat qilish uchun ishlatilgan. SARS-CoV-2 da b-barrel transmembran oqsillari mavjud emas.
Eksperimental tarzda aniqlangan tuzilmalarning mavjudligi. PSI-BLAST, modellashtirish uchun shablon sifatida ishlatilishi mumkin bo'lgan Protein ma'lumotlar bankida (PDB) mavjud bo'lgan qisman yoki to'liq tuzilmalar bilan gomologlarni aniqlash uchun ishlatilgan.
Yuqori darajada saqlanib qolgan bir nechta SARS-CoV-1 oqsillari eksperimental ravishda echilgan va bizning tahlilimiz uchun mavjud. Ushbu tuzilmalardan ma'lumotlarni to'g'ri tarjima qilishni maksimal darajada oshirish uchun aminokislotalarning o'rnini bosuvchi moddalar oqsil konformatsiyasiga ta'sir qilishi mumkin bo'lganlarni aniqlash uchun tahlil qilindi. Protein tuzilishiga ta'sir etuvchi o'zgarishlarga misol qilib, gidrofobik yon zanjirning oqsil yadrosida zaryadlangan aminokislota bilan almashtirilishi yoki spiral strukturada prolin (spiral "uzuvchi") bilan almashishi mumkin. Agar bunday almashtirishlar topilmasa va oqsil shablonga
70% dan ortiq o'ziga xoslikka ega bo'lsa, halqalar va almashtirishlar Rosetta remodel (Huang va boshq. 2011) va fixbb (Hu va boshq. 2007 Kuhlman) yordamida mahalliy modellashtiriladi (LM). va Baker 2000) ilovalari mos ravishda. Yaqinda chiqarilgan kristallografik tuzilmalarni sinchkovlik bilan tahlil qilingan oqsil ketma-ketligi va tanlangan hududlar uchun LM yordamida yaratilgan modellar bilan taqqoslash samarali yondashuv bo'lib ko'rinadi (Prates va boshq. 2020). Yuqori mahalliy rezolyutsiyaga erishish, ayniqsa substrat/ligand bog'lanish joylarida molekulyar docking yordamida kichik molekula nomzodlarini aniqlash bo'yicha keyingi tadqiqotlar natijalarini sezilarli darajada oshirishi mumkin. Ansamblni joylashtirish yondashuvlari ko'pincha oqsil nishonining konformatsion moslashuvchanligi bilan kurashish uchun qo'llanilsa-da, agar mavjud bo'lsa, holo shaklidagi homologlarning tizimli ma'lumotlari asosida bog'lanish joyini tozalash funktsional komplekslarni aniqlash uchun ko'proq mos keladi.
Gomologiyaga asoslangan modellashtirish odatda shablonning identifikatsiyasi 30% dan yuqori bo'lgan holatlar uchun optimal yondashuv hisoblanadi. I-TASSER (Yang va boshq. 2015) ish jarayonining fragmentga asoslangan (FB) yondashuvi identifikatsiya diapazoni 30-70% bo'lgan hollarda va o'rnini bosuvchi oqsillarni o'z ichiga olgan hududlarda LMga muqobil modelni taqdim etish uchun ishlatilgan. Bu protein konformatsiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatishi kutilmoqda. Gomologning kristalli tuzilishi mavjud bo'lmagan oqsillar tuzilmalarini bashorat qilish uchun biz trRosetta (Yang va boshq. 2020) ish jarayonini qo'lladik. Protein tuzilishini bashorat qilish texnikasini tanqidiy baholash (CASP13) mezonlariga asoslanib, trRosetta energiyani minimallashtirishni boshqaradigan qoldiqlararo masofa va yo'nalishni bashorat qilish uchun chuqur qoldiq tarmog'idan foydalangan holda yangi burmalarni modellashtirishda yaxshi samaradorlikka erishish uchun ishlab chiqilgan. Prates va boshqalarda. 2020 yilda biz ish jarayonini tasvirlash uchun
Proteinlardagi qoldiq aloqalarini aniq prognoz qilish ilmiy hamjamiyat oldida turgan uzoq davom etadigan muammodir. Bugungi kunda qoldiq kontaktlarini bashorat qilish odatda ikkita algoritmdan biri yoki ikkalasini qo'llaydigan dasturlaryordamida amalga oshiriladi: evolyutsion ulanish (EC) tahlili va nazorat ostida mashinani o'rganish (SML).
EK usullari oqsil oilalaridagi qoldiq juftlarining muvofiqlashtirilgan o'zgarishlarini aniqlash uchun faqat ketma-ketlik ma'lumotlaridan foydalanadi. Ishtirokchi qoldiqlar orasidagi bu muvofiqlashtirilgan o'zgarishlar odatda oqsilning tuzilishi va funktsiyasini saqlab qolish uchun evolyutsion bosim bilan ta'minlanadi. Ko'p yillar davomida oqsillar oilasidagi aminokislotalarning birgalikdagi evolyutsion naqshini tahlil qilish orqali qoldiq juftliklari bilan aloqa qilishni bashorat qilish (1-rasm) qo'llaniladigan statistik model bilan cheklangan. Mahalliy statistik model deb ataladigan aniq kontakt bashoratlarini ajrata olmadi, ya'ni bevosita ( A – B va B – C ) bilvosita dan aloqa qoldiqlarining kovaring juftlari A – C ) kovaradigan, lekin aloqada bo'lmagan juft qoldiqlar. Bir necha yil o'tgach, lekin yaqin vaqtgacha unutilgan, Lapedes va hamkasblari ushbu to'siqni muvaffaqiyatli yengib o'tish uchun birinchi bo'lib global statistik modelni qo'llashdi (Lapedes). va boshqalar. , 1999). Yaqinda turli tadqiqot guruhlari ushbu kontseptsiyani qayta ko'rib chiqdilar va bir xil global modelning turli xil o'rganish tartib-qoidalari orqali kontakt bashoratlarining aniqligini sezilarli darajada yaxshilashga muvaffaq bo'lishdi. Ba'zilar teskari kovariatsiya matritsasini baholash printsipiga tayanadi (Markos va boshqalar. , 2011 yil belgilari va boshqalar. , 2011 Jons va boshqalar. , 2012), psevdo-ehtimolga asoslangan yondashuvlar eng aniq bashoratlarga olib kelishi ko'rsatilgan (Balakrishnan). va boshqalar. , 2011 Ekeberg va boshqalar. , 2013 yil
Kamisetti va boshqalar. , 2013). Biroq, bu usullar samarali bo'lishi uchun etarli ketma-ketlik gomologlarining mavjudligiga qat'iy tayanadi (qarang, masalan, Morcos va boshqalar. , 2011 yil Kamisetti va boshqalar. , 2013 yil Jons va boshqalar. , 2015 yil belgilari va boshqalar. , 2012 yil Ovchinnikov, Kim va boshqalar. , 2015 Skwark va boshqalar. , 2014). Shunga qaramay, oqsillar ketmaketligi ma'lumotlar bazalari hajmining tezlashishi bilan birga (UniProt Konsortsiumi, 2015), bu kontaktlarning aniq prognozini haqiqatga aylantirdi (Marks). va boshqalar. , 2012 de Xuan va boshqalar. , 2013).
X-nurli kristallografiya yoki kriyo-EM yordamida strukturani aniqlash jarayonida (chapdan o'ngga) bir nechta oqsil ketma-ketligi hizalanishidan (markazda) olingan kontakt bashoratlari turli nuqtalarning sxematik tasviri. Eritmaning tarqalishi ma'lumotlari va NMR tajribalari uchun ilovalar pastki o'ngda ko'rsatilgan.
SML usullari aloqa qoldiq juftlarini bashorat qilish uchun ketma-ketlikka bog'liq va ketma-ketlikdan mustaqil ma'lumotlardan foydalanadi (Cheng & Baldi, 2005
Shackelford & 38 Karplus, 2007 González va boshqalar. , 2013 yil Vang & Xu,
2013 yil Chjan va boshqalar. , 2016 Du va boshqalar. , 2016). Ushbu usullar oqsil xususiyatlarini, ketma-ketlik profillarini va o'zaro ma'lumotlarni tahlil qilish orqali kontaktlarni keltirib chiqaradi. Umuman olganda, EC usullaridan past bo'lsa-da, SML algoritmlari kamroq gomologik ketma-ketliklarga ega bo'lgan oilalar uchun
EC algoritmlaridan ustun bo'lishi mumkin (Skwark). va boshqalar. , 2014 yil Vang & Xu, 2013 yil Ma va boshqalar. , 2015 ).
SML usullari bir vaqtning o'zida qoldiq juftlarini o'rganganligi va bashorat qilganligi sababli, ular to'g'ridan-to'g'ri va bilvosita kovaring qoldiq juftlarini ajrata olishda mahalliy statistik modellarni qo'llagan eski EK usullarida ko'rinib turganidek, xuddi shunday qobiliyatsizligidan aziyat chekmoqda. Biroq, ushbu potentsial qimmatli ma'lumotni ko'rib chiqish uchun so'nggi yondashuvlar ikkala toifadagi usullarni birlashtiradi: EC va SML. SML bashoratlari EC usullaridan oldingi sifatida ishlatilishi mumkin, bunga misol bo'lishi mumkin GREMLIN (Ovchinnikov, Kinch va boshqalar. , 2015) yoki ketma-ketlik profillari bilan birga bir nechta EC usullarining chiqishi SML usullarida xususiyat sifatida ishlatilishi mumkin, masalan MetaPSICOV (Jons va boshqalar. , 2015) va PconsC 2 (Skvark va boshqalar. , 2014). Turli xil EC va SML usullarini birlashtirgan quvurlar ko'pincha metaprediktorlar deb ataladi va eng yaxshi usullarning foydali taqqoslanishi yaqinda nashr etilgan (Vang. va boshqalar. , 2017). Ko'pgina hollarda, metaprediktorlar kontaktni bashorat qilishning aniqligi bo'yicha individual EC yoki SML usullaridan ustun turadi, ammo strukturani bashorat qilishning yaxshilanishi unchalik aniq emas. Kontaktni bashorat qilish aniqligining yaxshilanishi, ayniqsa, mavjud ketmaketliklar kamroq yoki kamroq xilma-xil bo'lgan hollarda sezilarli bo'ladi (de Oliveyra va boshqalar. , 2016 Wuyun va boshqalar. , 2016). Kontaktni bashorat qilish uchun asosiy manbalar 1-jadvalda keltirilgan.
Global statistik modelni amalga oshiradigan eng qadimgi EC usullari bilan bir qatorda, foydali kontaktlarni bashorat qilish uchun zarur bo'lgan bir nechta ketmaketlikni moslashtirishning minimal hajmini taxmin qilish uchun ko'plab qo'llanmalar taklif qilingan. Dastlab, 1000 ta ketma-ketlik gomologlari aniq bashorat qilish uchun minimal deb hisoblangan (Jons va boshqalar. , 2012 yil belgilari va boshqalar. , 2012 Andreani & Söding, 2015 yil). Yaqinda Marks va hamkasblari o'z usullari uchun ko'proq ketma-ketlikka xos uzunlikka bog'liq omilni tavsiya
qilishdi. EVFold , bunda yaxshi olish uchun hizalanishdagi ketma-ketlik soni oqsil uzunligidan besh marta oshib ketishi kerak ab initio katlama natijalari (Marks va boshqalar. , 2012). Boshqalar ham shunga o'xshash talablarni taklif qilishgan (Kamisetty va boshqalar. , 2013), ammo so'nggi ishlar kovariatsiyani aniqlash algoritmlarini yaxshilash orqali bu chegarani biroz pasaytirdi (Ovchinnikov, Kinch). va boshqalar. , 2015) yoki prognoz qilingan aloqa xaritasini dekodlash uchun tizimli ma'lumotlardan foydalanish (Jeong & Kim, 2016). Biroq, bu taxminlarning hech biri ketma-ketliklar to'plamidagi xilma-xillikni ushlamaydi, bu kontaktni aniq bashorat qilish uchun ham muhimdir va shuning uchun ular noto'g'ri bo'lishi mumkin. Eng so'nggi ko'rsatmalardan biri taxminan 80% ketma-ketlik identifikatorida klasterlashgandan so'ng bir nechta ketma-ketlikni moslashtirishdagi xilma-xillikni ko'rib chiqadi: samarali ketma-ketliklar soni. Garchi turli guruhlar ketma-ketlikni aniqlashni tanlashda farq qilsalar ham (Markos va boshqalar. , 2011
Jons va boshqalar. , 2015 Skwark va boshqalar. , 2014 yil Hopf va boshqalar. , 2012), umumiy konsensus shuni ko'rsatadiki, samarali ketma-ketliklar soni hizalanish xilma-xilligining eng samarali o'lchovidir va shuning uchun bashorat aniqligining foydali prognozchisi. Eng so'nggi EC usullari eng yaxshi kontaktlarni bashorat qilish to'g'ri bo'lishi uchun taxminan 100 � samarali ketma-ketlikni talab qiladi (Jons va boshqalar. , 2015 Skwark va boshqalar. , 2014). To'g'ri bashorat qilinishi mumkin bo'lgan kontaktlarning soni samarali ketma-ketliklar soni bilan ortadi: aniq uch o'lchovli struktura modellarini yaratish uchun taxminan besh baravar ko'proq ketma-ketliklar kerak (Ovchinnikov). va boshqalar. , 2017 ).
Hozirgi vaqtda qoldiq-kontakt juftligini bashorat qilish uchun qo'llaniladigan usullar molekulyar va molekulalararo kontaktlarni ishonchli ajrata olmaydi, ammo ikkalasini ajratish quyida keltirilgan ko'plab usullarning optimal ishlashi uchun muhimdir. Intramolekulyar qoldiq kontaktlarini bashorat qilish odatda osonroqdir, chunki bitta protein ketma-ketligini moslashtirish etarli. Biroq, agar maqsad gomooligomerlarni hosil qilsa, yakuniy aloqa bashorati, agar ular struktura va funktsiya uchun muhim bo'lsa va shuning uchun evolyutsion bosim ostida bo'lsa, molekula ichidagi va molekulalararo kontaktlarni o'z ichiga oladi. Bunday sharoitda bashorat qilingan aloqalarni talqin qilish noto'g'ri bo'lishi mumkin. Shu bilan birga, agar monomerik yoki dimerik oqsil tuzilishi uchun strukturaviy ma'lumot mavjud bo'lsa, bashorat qilingan aloqa ma'lumotlari kuchli bashorat qilingan, ammo qoniqtirilmagan kontakt juftliklarini aniqlash orqali potentsial yangi oligomerik holatlarni aniqlashda muhim bo'lishi mumkin (Hopf). va boshqalar. , 2012 yil yanvar va boshqalar. , 2014 ).
Gomo-oligomerlardagi molekulyar va molekulalararo kontaktlarni ajratish bo'yicha strukturaviy ma'lumot mavjud bo'lmaganda, foydalanish imkoniyatini bashorat qilish yordam berishi mumkin: molekulyar sirtda qoldiqlar juftligi bilan aloqa qiladigan nomzodning ikkalasi ham taxmin qilinsa, molekulalararo kontakt ko'proq bo'ladi. Ba'zi kontaktlarni bashorat qilish algoritmlarida molekula ichidagi kontaktlarni (masalan, PconsC 2 Skvark va boshqalar. , 2014), erituvchiga kirish mumkin bo'lgan sirt maydonini bashorat qilish usullarini davom ettirish (Xeffernan) va boshqalar. , 2015) bashorat qilingan aloqa xaritalarida molekulyar va molekulalararo kontaktlarning bo'linishini osonlashtirishi kerak. Transmembran oqsillari uchun lipofillik prognozlari odatda membranaga qaragan qoldiqlarni aniqlash uchun ishlatiladi (Koehler Leman va boshqalar. , 2015), bu ikki qatlamdagi molekulalararo kontaktlarni ajratishga yordam berishi mumkin.
Hetero-oligomerik oqsil komplekslari holatlarida, kontakt juftlarini bashorat qilishda boshqa qiyinchilikka duch keladi. Molekulyar va molekulalararo kontaktlarni ajratish talab etilmasa ham, EK usullari uchun bir nechta ketma-ketlikni yaratish juda qiyin, chunki ortologik o'zaro ta'sir qiluvchi ketma-ketlik juftlari ko'p sonli turlardan ishonchli tarzda aniqlanishi kerak. Odatda, individual hizalanishlardan olingan ketma-ketliklar bakterial genom koordinatalari yordamida juftlashtiriladi, ya'ni Ularning genomdagi joylashuvi qanchalik yaqin bo'lsa, ularning birgalikda ifodalanishi va jismoniy o'zaro ta'siri shunchalik yuqori bo'ladi (Ovchinnikov va boshqalar. , 2014 yil Hopf va boshqalar. , 2014 yil Skerker va boshqalar. , 2008). Bu ma'lumot juda muhim, chunki oqsil va oqsil o'zaro ta'sirining saqlanishi barcha gomologlar orasida mavjud bo'lmasligi mumkin. Ushbu yondashuvdan foydalangan holda bir nechta tadqiqotlar EK usullarining geterooligomerik oqsil komplekslariga qo'llanilishini ko'rsatdi. Masalan, Hopf va uning hamkasblari DinJ–YafQ (Hopf) kompleksi interfeysidagi 19 qoldiq kontaktdan 17 tasini to'g'ri bashorat qilishdi. va boshqalar. , 2014). Ovchinnikov va uning hamkasblari 50S ribosoma subunit kompleksi oqsillari va boshqa protein
komplekslari o'rtasida bir nechta kontaktli qoldiq juftlarini ishonchli tarzda bashorat qilishdi (Ovchinnikov). va boshqalar. , 2014). Har bir holatda, bashorat qilingan aloqa ma'lumotlari individual tarkibiy tuzilmalar asosida oqsil komplekslarining aniq modellarini aniqlash imkonini berdi. Protein interfeysi bilan aloqani bashorat qilish uchun ketma-ketlikni moslashtirish uchun ikkinchi, oddiyroq usul ishlab chiqilgan. Bu usul bakterial genomdan mustaqil va genomdan foydalangan holda ortologik ketma-ketlik juftliklariga mos keladi. PORTLASH ballar (Iserte va boshqalar. , 2015 yil Yu va boshqalar. , 2016 yil Ochoa & Pazos, 2010 yil). Umuman olganda, bu ikkinchi hizalanish avlodi usuli prokaryotik oqsillar uchun kamroq aniq mos keladigan juftliklar to'plamini ishlab chiqishi mumkin, ammo allaqachon eukaryotlarda oqsillar bilan o'zaro ta'sir qilish uchun foydali ekanligi isbotlangan (Iserte). va boshqalar. , 2015) va yangi usullar bu organizmlar uchun aniqlikni yaxshilaydi (Gueudré). va boshqalar. , 2016 Bitbol va boshqalar. , 2016).
Protein kristalli tuzilishini hal qilish uchun bosqichma-bosqich muammoni – faqat intensivlik ma'lumotlarini to'g'ridan-to'g'ri o'lchash qobiliyatini eksperimental yoki hisoblash vositalaridan foydalangan holda engish kerak. Kontaktni bashorat qilish, strukturaviy eritmaning hisoblash yo'li sifatida molekulyar almashtirish (MR) uchun eng mos keladi (1-rasm). MRda noma'lum maqsadli tuzilmaning kamida bir qismiga yaqin bo'lgan "qidiruv modeli" odatda ketma-ket aylanish va tarjima bosqichlari orqali nosimmetrik birlikda joylashgan. Keyinchalik bu joylashtirilgan struktura dastlabki elektron zichlik xaritalarini hisoblash imkonini beruvchi taxminiy faza ma'lumotlari manbai sifatida ishlatilishi mumkin. Biroq, MRni alohida ko'rib chiqishdan oldin, barcha bosqichma-bosqich yondashuvlar uchun protein maqsadining domen tuzilishini har tomonlama tushunish qiymatini takrorlash kerak.
Maqsad va ma'lum protein tuzilmalari yoki oilalari (domenlari) o'rtasidagi tan olingan evolyutsion munosabatlar eksperimental tuzilma yechimini
osonlashtiradigan xususiyatlar mavjudligini qimmatli ravishda bashorat qilishi mumkin. Masalan, metallni bog'lash, asosni bog'lash yoki kofaktor bilan bog'lash joylari har bir tabiiy ligandlarni yoki ularning sun'iy analoglarini, foydali anomal tarqalish xususiyatlariga va/yoki yuqori massaga ega atomlarni o'z ichiga olishi mumkin. Bunday hollarda bitta kristalli yoki ko'p kristalli diffraktsiya ma'lumotlari anomal tarqalish va / yoki izomorf almashtirish yondashuvlari bilan hal qilish uchun javob beradi (Dauter, 2002 Hendrickson, 2014). Hatto uzoq gomologiyalarni aniqlashning mashhur usullariga kiradi HHpred (Söding va boshqalar. , 2005 https://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred), Phyre (Kelli va boshqalar. , 2015 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/
phyre2/) va FFA S-3 D (Xu va boshqalar. , 2014 http://ffas.godziklab.org). Maqsadli va ma'lum tuzilmalar o'rtasidagi yashirin evolyutsion munosabatlarni tanib olishning bunday usullari kontaktni bashorat qilishdan ikki jihatdan foyda keltiradi.
Aminokislotalarni ajratish mumkin ion almashinadigan xromatografiya keyin ularni aniqlashni osonlashtirish uchun derivatsiya qilingan. Odatda, aminokislotalar hosil bo'ladi, so'ngra eritiladi teskari faza HPLC.
Ion almashinadigan xromatografiyaning namunasi MTRK tomonidan sulfatlangan polistirolni matritsa sifatida ishlatib, aminokislotalarni kislota eritmasiga qo'shib va ​​doimiy ravishda ortib boruvchi buferdan o'tkaziladi. pH ustun orqali. Aminokislotalar pH mos keladigan darajaga yetganda elutatsiya qilinadi izoelektrik nuqtalar. Aminokislotalarni ajratib bo'lgach, ularning ranglarini hosil qiluvchi hosil qiluvchi reaktiv qo'shib ularning tegishli miqdori aniqlanadi. Agar aminokislotalarning miqdori 10 nmoldan oshsa, ninhidrin buning uchun ishlatilishi mumkin; u prolin bilan reaksiyaga kirishganda sariq rang, boshqa aminokislotalar bilan esa jonli binafsha rang beradi. Aminokislota kontsentratsiyasi hosil bo'lgan eritmaning yutilishiga mutanosibdir. Juda oz miqdorda, soat 22.00 gacha, lyuminestsent hosilalar, masalan, reagentlar yordamida hosil bo'lishi mumkin orto-ftaldegid (OPA) yoki floresamin.
Ustundan oldingi derivatizatsiya ultrabinafsha nurlari bilan aniqlanadigan lotin hosil qilish uchun Edman reaktividan foydalanishi mumkin. Kattaroq sezgirlikka lyuminestsent lotin hosil qiluvchi reaktiv yordamida erishiladi. Hosil bo'lgan aminokislotalar, odatda C8 yoki C18 yordamida teskari fazali xromatografiyaga uchraydi. kremniy kolonu va optimallashtirilgan elution gradient.¹ Elitatsiya qiluvchi aminokislotalar ultrabinafsha yoki lyuminestsentsiya detektori yordamida aniqlanadi va
namunadagi har bir aminokislotani miqdorini aniqlash uchun hosil bo'lgan standartlar bilan taqqoslaganda eng yuqori joylar.