Методика проведения лабораторных анализов в свп, их клинико-диагностическое значение

Взятие биоматериала. Забор крови производят натощак после 6-8 часового голодания, шприцем из вены в сухую центрифужную пробирку в количестве 1,0-2,0 мл. Кровь оставляют на 10 мин, затем иглой осторожно отслаивают содержимое пробирки от стенок. Центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Берут сыворотку в отдельную пробирку. Сыворотка может храниться в замороженном состоянии 1 мес. Для анализа используют 0,02 мл сыворотки.
Реактивы:

1. 
   Буфер – фермент (1 флакон): 5,5-диэтилбарбитурат натрия 1,11 ммоль, ЭДТА 31,24 ммоль, уреаза 8 μкат/флакон, азид натрия 12,5%
   
2. 
   Салицилат натрия (1 флакон) 0,014 моль/флакон
   
3. 
   Нитропруссид натрия (1 флакон) 1,8 ммоль/флакон
   
4. 
   Гидрохлорит натрия (20 мл): гидрохлорит натрия 0,2 моль/л, гидроокись натрия 3 моль/л
   
5. 
   Стандартный раствор, мочевина 15 ммоль/л (10 мл).
   

Состав реакционной смеси:
Буфер барбиталовый 2,6 ммоль/л
Уреаза 8,85 мккат/л
Салицилат натрия 170 ммоль/л
Нитропруссид натрия 1,8 ммоль/л
Гидрохлорит натрия 4,4 ммоль/л
Гидроокись натрия 66 ммоль/л
Соотношение сыворотка/реакционная смесь 1/226
Приготовление растворов.
1. Раствор фермента в буфере. Содержимое флакона 1 растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Устойчивость: не менее 10 дней (с +2 до +8) ⁰С.
2. Раствор нитропруссида. Содержимое флаконов 2 и 3 растворяют в 400 мл дистиллированной воды. Устойчивость: не менее 14 дней (с +2 до +8) ⁰С в темноте.
3. Раствор гидрохлорита. Содержимое флакона 4 разбавляют дистил. водой до 400 мл. Устойчивость: не менее 1 месяц (с +2 до +8) ⁰С.
Условия анализа.
Длина волны (540 – 560) нм
Кювета 1 см
Температура инкубации (37 ±0,1) ⁰С реакции (с+15 до +25) ⁰С

Пошаговое проведение методики.
1. Берут сухие пробирки и номерует их (№1, №2, №3….).
2. Во все пробирки наливают по 0,02 мл сыворотки крови или разведенной мочи.
3. В отдельную пробирку (стандартная, реактив №5) наливают 0,02 мл стандартного раствора.
4. В отдельную пробирку (раствор сравнения) – контрольная проба ничего не добавляется
5. Во все пробирки добавляют по 0,50 мл раствора фермента в буфере.
6. Все пробирки перемешивают и инкубируют 10 мин при 37 ⁰С.
7. Во все пробирки добавляют по 2,0 мл раствора нитропруссида.
8. Во все пробирки добавляют по 2,0 мл раствора гидрохлорита
9. Сразу после добавления раствора гидрохлорита все пробирки перемешивают.
10. Через 15 мин (25 ⁰С) все пробирки снова перемешивают.
11. Измеряют оптическую плотность всех проб с сывороткой крови (А₁) и стандарта (А₂) против раствора сравнения.