Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

фрагментов (ПДРФ, или RFLP от англ. restriction fragment length 
polimorphism).
Метод ПДРФ (RFLP). Данный метод разработан в начале 1980-х гг. 
и основан на различиях в расстояниях между сайтами рестрикции в 
ДНК. Метод заключается в том, что последовательность ДНК, со-
держащая мутацию, может приобретать или, наоборот, утрачивать 
сайты рестрикции для тех или иных рестриктаз. В результате для оп-
ределенных последовательностей ДНК каждого из индивидуумов (или 
особей) характерен свой, уникальный набор фрагментов рестрикции, 
так же как для каждого человека характерен свой собственный рису-
нок отпечатков пальцев. Это можно выявить при разделении получен-
ных фрагментов электрофорезом и гибридизацией с радиоактивным 
зондом. Сопоставление радиоавтографов для нормального и му-
тантного генов в этом случае позволяет обнаружить разницу в ко-
личестве и положении «полос» (рис. 2.9) и дать ответ на вопрос о 
принадлежности ДНК тому или иному индивидууму (или особи). 
Подобная практика широко используется в судебной экспертизе при 
доказательстве отцовства, идентификации останков, характеристике 
улик и др. В микробиологии метод применим при идентификации 
микроорганизмов.
Для данного метода требуется достаточно большое количество 
ДНК, что часто неосуществимо (если, например, идентификация осу-
ществляется по мелким предметам – волосам, кусочкам ткани, кожи, 
слюне и др.). Поэтому данный метод часто не может обойтись без еще 
одного, чрезвычайно перспективного и весьма часто используемого 
метода – ПЦР (РСR). 
Метод ПЦР (полимеразной цепной реакции). Этот метод раз-
работан К. Маллисом и сотрудниками в 1985 г. и представляет собой 
ферментативную амплификацию сегментов ДНК или РНК, позво-
ляющую многократно воспроизводить интересующий эксперимента-
тора фрагмент ДНК (РНК) без помощи рестриктаз, векторов или кле-
ток хозяина. Метод осуществляется in vitro и полностью автоматизи-
рован. Для РСR-реакции необходимы два олигонуклеотида-праймера 
длиной около 20 нуклеотидов, комплементарных двум участкам на 
3
′-концах амплифицируемого фрагмента ДНК (рис. 2.11), набор де-
зоксинуклеозидтрифосфатов и термостабильная ДНК-полимераза. 
Праймеры синтезируют химическим способом, выяснив предвари-
тельно структуру комплементарных участков, с которыми они долж-
ны спариваться. Термостабильный фермент выделяют из термофиль-
ных бактерий Thermus aquaticus. 

---

120 
Рис. 2.11. Схема событий полимеразной цепной реакции
На первой стадии двухнитевую ДНК, выделенную из клеток, на-
гревают до 90ºС для денатурации (разделения цепей), затем смесь ох-
лаждают, чтобы произошла гибридизация праймеров с комплементар-
ными участками (отжиг). Далее устанавливают температуру, при ко-
торой происходит полимеризация цепей (70–75
°С, в этом интервале 
фермент наиболее активен). После этого все события цикла повторя-
ют, начиная с денатурации ДНК. Процесс осуществляется в термоста-
те-амплификаторе, работу которого контролирует компьютер. 
Данный циклический процесс повторяют с той же реакционной 
смесью 20–60-кратно. После третьего цикла амплификации начина-
ют накапливаться двухнитевые фрагменты ДНК, равные по длине 
расстоянию между двумя праймерами (рис. 2.11). В каждом после-
дующем цикле количество синтезированных фрагментов удваивает-
ся, т. е. за n циклов образуется 2
n
копий дуплексных сегментов с 
длиной, ограниченной праймерами. 
Практическое применение метода PCR имеет несколько аспектов. 
Во-первых, с помощью амплификации определенных последовательно-
стей ДНК, уникальных для определенных геномов или даже целых ге-

---

121 
нов, можно обнаружить данные сегменты даже при условии, что изна-
чально они присутствуют в клетках в очень малых дозах (числе копий). 
Например, начальные этапы вирусных инфекций характеризуются низ-
ким содержанием нуклеиновых кислот вирусов, но их можно обнару-
жить с помощью PCR-метода с последующей идентификацией при ис-
пользовании зондов, комплементарных искомым последовательностям.
Такие методы в настоящее время широко используют для детек-
ции вирусов кори и краснухи, а также холерного вибриона. Чувстви-
тельность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и обнаружить 
целевую последовательность можно даже в том случае, если она 
встречается однажды в образце из 10
5
клеток. Размноженный in vitro 
фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого сек-
венирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап 
клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР ино-
гда называют бесклеточным молекулярным клонированием. 
Еще одним приложением метода является диагностирование 
наследственных заболеваний. Для многих наследственных заболе-
ваний в настоящее время уже выявлены гены, а также их локусы, 
мутации в которых приводят к тяжелым болезням. Поскольку эти 
мутации передаются в поколениях индивидуумов, для ответа на во-
прос, будет ли будущий новорожденный нести ту или иную мута-
цию, требуется выявить ее у плода (пренатальная диагностика). Для 
этого приблизительно на 16-й неделе беременности производят от-
бор амниотической (околоплодной) жидкости, из которой можно 
выделить клетки плода в ходе центрифугирования. Из клеток извле-
кают ДНК. Получить препаративные количества фрагментов ДНК, 
предположительно содержащих мутации, можно двумя путями – 
клонированием соответствующих фрагментов или их амплификаци-
ей методом PCR. Второй способ гораздо проще и дешевле. После 
того как искомый фрагмент ДНК получен в достаточном количе-
стве, можно осуществить его секвенирование и сопоставить нуклео-
тидные последовательности нормального и анализируемого генов. 
Существует и более простой способ выявления мутаций во фраг-
ментах ДНК – блот-гибридизация.