Microsoft Word 60 2012 Белясова doc
Download 5.01 Kb. Pdf ko'rish
|
belyasova molekulyarnaya biotexnologiya
- Bu sahifa navigatsiya:
- Стабилизация мРНК и белкового продукта чужеродного гена.
- « молекулярный фингерпринтинг »
|
часть прокариотического гена таким образом, чтобы SD-последова- тельность второго гена располагалась непосредственно в кодирующей области первого. При этом терминирующий трансляцию кодон первого гена является частью инициирующего кодона второго гена. Этот метод разработан в 1985 г. в СССР. Он позволяет достигать 100%-ной ини- циации трансляции второго гена, поскольку рибосомы, транслировав- шие первую часть полицистронной мРНК, не отсоединяются от нее, а происходит реинициация трансляции второго гена. Таким образом, применение векторов с частично перекрывающимися генами в оперо- нах позволяет обеспечить эффективность инициации трансляции чуже- родного гена не ниже, чем у исходного прокариотического цистрона. Стабилизация мРНК и белкового продукта чужеродного гена. На стабильность мРНК в клетке влияют ее первичная и вторичная структура. Сохранение шпилечных структур на 3 ′-конце после терми- нации транскрипции, по-видимому, значительно увеличивает период полужизни мРНК. Для других мРНК доказано, что их стабильность во многом определяется структурой некодирующей 5 ′-области. Изменяя эти элементы при конструировании гибридных генов, добиваются по- вышения стабильности мРНК. Стабильность мРНК в клетках бактерий можно повысить также введением мутаций, инактивирующих РНК-азы. Кроме этого, на ста- бильность мРНК влияет полинуклеотидфосфорилаза (Pnp). Известны мутанты E. coli по генам pnp, в которых время полужизни мРНК, оп- ределяющей чужеродные белки, увеличивается в 1,5 раза. Серьезным препятствием при получении штаммов-сверхпроду- центов может стать протеолиз чужеродных белков в клетке. Ведь на- бор клеточных пептидаз как раз и предназначен в основном для быст- 118 рой деградации полипептидов с «аномальной» структурой, которые возникают, например, в результате ошибок трансляции. Для стабили- зации чужеродных белков в качестве реципиентов можно использо- вать штаммы, дефектные по системе деградации белков (lon-, htpR- или deg-мутанты). Можно также вводить в бактериальную клетку ген pin бактериофага Т4, который контролирует синтез ингибиторов протеаз, или другие гены с похожими функциями. Значительное влияние на активность протеаз клетки оказывают ус- ловия культивирования бактерий, и прежде всего состав питательных сред. В частности, известно, что протеолиз увеличивается при дефици- те аминокислот, фосфатов, сульфатов. Недостаток аммония, а также культивирование при повышенной температуре приводят к сверхпро- дукции протеаз. Известно, что катионы цинка ингибируют действие протеаз E. coli. Поэтому введением в питательную среду определенно- го количества Zn 2+ можно добиться значительного увеличения уровня чужеродного белка, синтезируемого в клетках этих бактерий. Сочетание всех перечисленных факторов может обеспечивать в клетках E. coli удивительно высокий выход целевых белков, превы- шающий 50% суммарного содержания белка в бактерии. 2.6. Методы молекулярного маркирования Под молекулярными маркерами понимают фрагменты ДНК, ко- торые могут быть использованы в качестве генетических различий при идентификации особей или их генов, так же как в судебной практике используют отпечатки пальцев для идентификации индивидуумов. Не зря процесс исследования особей или индивидуумов на молекулярном уровне носит название «молекулярный фингерпринтинг». Возмож- ность использования молекулярных маркеров основана на том, что у отдельных особей даже одного вида существует определенная генети- ческая вариабельность, иными словами, многие последовательности ДНК являются полиморфными, т. е. отличаются у индивидуумов. Ме- тоды молекулярного маркирования как раз и используют эту генетиче- скую вариабельность для идентификации особей и их генов. Первыми молекулярными маркерами, используемыми в методах генетической инженерии, стали фрагменты, образованные при рас- щеплении ДНК рестрикционными ферментами. Выявление разли- чий в длине фрагментов, полученных из ДНК различных особей од- ного вида или их генов после расщепления рестриктазами, дало на- чало методу определения полиморфизма длин рестрикционных |
