Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Получение делеций и инсерций с помощью рестриктаз. 
Делеции. Эти типы мутаций при локализованном мутагенезе лег-
че всего получить с помощью эндонуклеаз. Используют как рестрик-
тирующие, так и неспецифические эндонуклеазы. Наиболее простой 
случай использования рестриктаз состоит в расщеплении какого-либо 
генома с помощью рестриктазы, вносящей несколько разрывов с обра-
зованием «липких» концов. Полученные фрагменты вновь замыкают в 

---

123 
кольцо с помощью ДНК-лигазы, что может привести к образованию 
молекул, не содержащих один из сегментов ДНК. При таком подходе 
формируются протяженные делеции, и его используют, как правило, в 
предварительных экспериментах, чтобы определить функции относи-
тельно больших участков клонированной ДНК. 
Небольшие делеции получают следующим образом. Клонирован-
ный фрагмент расщепляют в составе вектора в подходящем сайте с по-
мощью рестриктазы (рис. 2.12). 
Рис. 2.12. Получение делеций в клонированных фрагментах ДНК
с помощью рестрикционных ферментов (темным цветом выделена
чужеродная ДНК, светлым – ДНК вектора) 
Образовавшуюся линейную молекулу обрабатывают экзонуклеа-
зой III, которая гидролизует в составе ДНК одну цепь, начиная с
3
′-конца. В результате получается набор молекул с одноцепочечными 
5
′-хвостами разной протяженности. Эти хвосты гидролизуют нуклеа-
зой S1, специфичной к одноцепочечной ДНК, и в ДНК формируются 
+ Bal 31 
+ Нуклеаза S1 

---

124 
делеции. Можно также применять экзонуклеазу Bal 31, которая катали-
зирует деградацию обеих цепей, начиная с концов линейных молекул 
ДНК. Ход нуклеазных реакций регулируют, варьируя время инкуба-
ции, температуру и концентрацию фермента, индуцируя образование 
делеций разной длины. Полученные делеционные варианты линейных 
ДНК часто перед циклизацией снабжают линкерами, чтобы в районе 
делеции присутствовали рестрикционные сайты. Существуют и другие 
модификации описанных методов.