Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Сайт-специфический мутагенез. Охарактеризованные методы 
локализованного мутагенеза отличаются тем, что сайты, где проис-
ходят мутации, выбираются случайно. В то же время техника сайт-
специфического мутагенеза позволяет вводить мутации в точно оп-
ределенный участок гена. Это осуществляется с использованием 
синтетических (полученных химическим синтезом) олигонуклеоти-
дов с заданной последовательностью. Метод привлекателен тем, что 
не требует присутствия удобных сайтов рестрикции. В основу метода 
положено образование гетеродуплексов между синтетическим оли-
гонуклеотидом, содержащим мутацию, и комплементарной однони-
тевой ДНК в составе вектора. 
Поступают следующим образом. Синтезируют небольшой олиго-
нуклеотид (8–20 мономеров), комплементарный той части гена, в ко-
торой хотят получить мутацию. В составе олигонуклеотида в цен-
тральной области допускают одну или несколько нуклеотидных за-
мен. Клонируют исследуемый ген или его фрагмент в составе вектора 
на основе фага М13, чтобы получить кольцевые одноцепочечные ре-
комбинантные ДНК. Производят смешивание и отжиг рекомбинант-
ных векторов с олигонуклеотидами. Происходит гибридизация олиго-
нуклеотида с комплементарной областью, при этом некомплементар-
ные нуклеотиды остаются неспаренными. Олигонуклеотид выполняет 
роль праймера в полимеразной реакции с участием ДНК-полимеразы 
in vitro. Кольцо замыкают лигазами. Полученная кольцевая молекула 

---

128 
вводится в клетки E. coli, где происходит частичная репарация му-
тантных участков и репликация. Частота мутаций обычно варьирует 
от 1 до 50%.
Отбор клеток, содержащих мутантные молекулы ДНК, можно 
производить несколькими способами, среди которых преимущества 
имеет метод с использованием радиоактивно меченного олигонуклео-
тида, который применяется для мутагенеза. В данном случае этот нук-
леотид служит зондом. Принцип использования такого зонда основан 
на том, что он полностью комплементарен мутантной ДНК и частично 
комплементарен ДНК дикого типа. Можно подобрать такие условия 
гибридизации (в первую очередь, температуру), при которых гибри-
дизация меченого зонда будет стабильной только с мутантной после-
довательностью ДНК, что можно выявить на радиоавтографе. 
Метод сайт-специфического мутагенеза особенно ценен тем, что 
позволяет изолировать мутации без контроля их фенотипического 
проявления. Этот метод открывает новые возможности исследования 
функций регуляторных элементов генов, позволяет изменять «силу» 
промоторов, оптимизировать сайты связывания с рибосомами и т. д. 
Одним из основных применений данной методологии является белко-