Microsoft Word 60 2012 Белясова doc

Сегмент-направленный мутагенез in vitro. Статистический му-
тагенез плазмидных ДНК методически гораздо проще, чем направ-
ленный. При желании мутагенной обработке можно подвергать изо-
лированные фрагменты ДНК и затем вводить их в изучаемый геном. 
Это одна из разновидностей сегмент-направленного мутагенеза. При 
таком подходе обычно расщепляют интересующий ген рестриктазами, 
фракционируют полученные фрагменты в ходе гель-электрофореза, 
вырезают интересующие сегменты и обрабатывают их мутагеном. 
Другими, более перспективными подходами являются те, в кото-
рых не используют мутагенные вещества. Обычно в результате такой 
разновидности сегмент-направленного мутагенеза получаются то-
чечные мутации, представляющие собой замену нуклеотидов. Для их 
получения можно использовать несколько подходов: дезаминирова-
ние цитозина, включение аналогов нуклеотидов, неправильное вклю-
чение нуклеотидов при репарации пробела и др. 
Первый способ основан на том, что остатки цитозина в одноцепо-
чечной ДНК можно дезаминировать с образованием урацила с помо-
щью обработки ионами бисульфита. 
Но для этого необходимо получить одноцепочечные бреши в 
ДНК в результате разрыва одной цепи. Одноцепочечные участки в 
ДНК получают обычно вблизи сайтов рестрикции, например, при дей-
ствии экзонуклеазы III (при импульсной обработке в присутствии 
бромистого этидия, который из-за интеркаляции между цепями ДНК 
затрудняет расщепление ферментом обеих цепей). Есть и более со-
вершенные способы получения одноцепочечных участков в ДНК. 
После обработки бисульфитом одноцепочечные бреши застраи-
вают с помощью ДНК-полимеразы и лигируют концы. В сайтах, где 
вместо цитидилата при дезаминировании образовался уридилат, ком-
плементарное положение займет аденилат, а при репликации такой 
молекулы произойдет замена пары GС на пару AT. Азотистая кислота 
дает более широкий спектр транзиций: она дезаминирует цитозин до 
урацила, аденин до гипоксантина и гуанин до ксантина. Спаривание 
урацила с аденином приводит к транзиции GC 
→ TA. Особенности 
спаривания гипоксантина таковы, что он может вызывать транзицию 
АТ 
→ GC. Ксантин не обусловливает мутаций. Он является «бес-

---

126 
смысленным» основанием, которое не комплементарно обоим пири-
мидинам, следовательно, его появление в ДНК должно оказывать ле-
тальное действие.
Другой подход при индукции замен состоит в образовании в ДНК 
небольшого однонитевого пробела, который затем застраивают в при-
сутствии ДНК-полимеразы, dATP, dGTP, dCTP и N-4-гидроксицито-
зинтрифосфата вместо dTTP. Гидроксицитозинтрифосфат включается 
в цепь вместо тимидилата, но при репликации ДНК спаривается оди-
наково хорошо и с аденилатом, и с гуанилатом. В результате включе-
ния гуанилата после дополнительного раунда репликации в данном 
сайте произойдет замена АТ 
→ GC (рис. 2.13). Поскольку в данном 
методе замена нуклеотидов осуществляется внутри сайта рестрикции, 
появляется возможность легко различить векторы с исходной после-
довательностью и мутантные. Для этого достаточно обработать их ис-
пользуемой в эксперименте рестриктазой: мутантные молекулы не 
подвергнутся расщеплению. 
Рис. 2.13. Получение замен нуклеотидов
в процессе локализованного мутагенеза 
Похожий метод основан на использовании только трех из четырех 
возможных нуклеотидов при заполнении однонитевой бреши ДНК-
полимеразой. В большинстве случаев фермент останавливается в том 
месте молекулы, где встречается комплементарный отсутствующему 
нуклеотид. Однако изредка ДНК-полимераза ошибается и включает 

---

127 
один из трех присутствующих нуклеотидов. Это приводит к образова-
нию кольцевых молекул, в составе которых присутствуют неспарен-
ные некомплементарные азотистые основания. При введении таких 
векторов в клетки бактерий в части молекул произойдет репарация та-
кого повреждения. В результате в половине молекул после реплика-
ции восстановится исходная последовательность, а в другой половине 
закрепится мутация. Отличить мутантные молекулы можно описанным 
выше способом. 
Таким образом, сегмент-направленный статистический (случай-
ный) мутагенез можно осуществлять альтернативными методами. По-
лучающийся при этом широкий спектр мутантов позволяет проводить 
исследование структурно-функциональной организации изучаемого 
локуса. Недостатки данного подхода состоят в том, что с его помощью 
сложно получить мутант со строго определенными заменами нуклео-
тидов и нельзя ввести в ДНК заранее запланированные делеции и 
вставки. Эти возможности обеспечивает сайт-специфический (олиго-
нуклеотид-направленный) мутагенез.