O„zbekiston respublikasi oliy va o„rta maxsus ta‟lim vazirligi qarshi davlat universiteti biotexnologiya kafedrasi
Download 0.81 Mb. Pdf ko'rish
|
O„zbekiston respublikasi oliy va o„rta maxsus ta lim vazirligi q
- Bu sahifa navigatsiya:
- 2.2. Oqsil miqdorini aniqlash
|
2-BOB. MАTЕRIАL ВА MЕTODLАR
2.1. Mitoxondriyalarni ajratib olish Mitoxondriyalarni Shneyder usuli bo‗yicha differensial sentrifugalash orqali 150-200 grammli kalamushlar jigaridan ajratib oldik [Schneider, Hogeboom, 1951; Виноградов и др., 1977]. Kalamush avval harakatsizlantirilib, keyin jigari tanadan ajratib olindi va muzli ajratish muhitiga solindi. Ajratish muhiti tarkibi quyidagicha: saxaroza 250 mM, tris-НСI 10 mM, EDTA 1 mM, рН 7,4. Jigarning massasi aniqlab olingandan so‗ng, mexanik press orqali ezildi va 6 hissa ko‗p ajratish muhitiga solib teflonli gomogenezator yordamida maydalandi. Birinchi sentrifugalash SLR-1 sentrifuganing rotoriga 0(1o S haroratda 7 daqiqa davomida daqiqasiga 1500 aylanish tezligida amalga oshirildi, so‗ngra cho‗kmaga tushgan yadro va hujayraning boshqa fragmentlari ajratib olindi. Supernatantni 2-marta daqiqasiga 6000 aylanish tezligida 15 daqiqa davomida sentrifuga rotoriga qo‗yildi. Cho‗kmani 10:1 nisbatdagi ajratish muhitida suspenziyalandi. Ajratib olingan mitoxondriya tajriba uchun 40 daqiqa davomida muzli banyada tinim holatiga qo‗yildi. 2.2. Oqsil miqdorini aniqlash Oqsilni biuret reaksiyasi bo‗yicha aniqladik [Gornal, 1949]. Biuret reaktivini tayyorlash uchun 750 mg mis sulfat (CuSO4*5H2O) va natriy-kaliy vinnokisliy (NaKC 4 H 4 O 6 * 4H 2 O) ni 500 ml suvda eritdik. Oksidlanishni oldini olish uchun tayyor eritmaga 150 ml 10% li natriy gidroksid (NaON) va 1 g kaliy yodid (KJ) qo‗shdik va hajmini suv yordamida 1 l ga yetkazdik. Tayyor eritmani polietilen idishda saqladik. Mitoxondriya suspenziyasidagi oqsil miqdorini aniqlash uchun 0,1 ml suspenziyaga membranani buzish uchun 0,9 ml 2n KON va 10 mg dezoksixolat 38 kislota qo‗shdik. Oqsil to‗liq erigandan so‗ng, 4 ml biuret reaktivi qo‗shildi xona haroratida 30 daqiqa davomida qoldirildi. Bir vaqtda kontrol proba (1 ml 2n KON + 10 mg dezoksixolevoy kisloti + 4 ml biuretovogo reaktiva) tayyorlandi. 10 mm qalinlikdagi kyuvetada 540 nm ko‗rsatkichda kalorimetrovka qilindi. Oqsil miqdori kalibrovka egri chizig‗i bo‗yicha aniqlandi (standart sifatida ho‗kizning sivorotkali albumini ishlatildi). Download 0.81 Mb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|