Pharmaceutical Microbiology Manual

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 51 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
Buffer No. 4 are prepared. Diluents are specific to each antibiotic and are listed 
in USP <81>.
E. Growth Media and Additional Test Solutions 
In order to culture a pure and robust test organism, proper use and preparation 
of growth media (agar or broth), buffers and diluents is required. Components 
or final preparations of growth media, reagents or diluents may be prepared 
on-site and/or purchased from outside sources. Regardless of origin, any final 
product made from growth media components and/or preparations must be 
verified for identification, expiry, sterility and growth promotion, prior to use in 
test. Refer to USP <81> for preparation, use and storage of all growth media, 
buffers and diluents. 
F. Antibiotic Potency Testing: Plate Method
The Plate Method is the most commonly used USP <81> test. The Plate 
Method uses a solid medium (agar) to demonstrate antibiotic activity (i.e. 
zones of inhibitions (ZOIs)). This method requires the use of a five-point 
standard curve [S1] – [S5], median reference standard [S3], test antibiotic/ 
unknown sample [U3], verified inoculum, stainless steel penicylinders and 
petri-plates containing growth agar. See Diagram 1 for an example of one 
independent test run for the Plate Method and placement of the standard curve 
and unknown sample onto triplicate agar plates.
Depending upon the antibiotic, either a single layer or bi-layer agar plates are 
used in test. See USP <81> for preparation for single and bi-layer agar plates.
1. Single Layer Plates: Prior to solidification, the growth agar is 
inoculated with a known volume of the verified test microorganism. 
The inoculated agar is thoroughly mixed, poured into a petri-plate 
and allowed to solidify. 
 
2. Bi-layer Plates: Prior to solidification, a portion of the growth agar is 
poured into the base of a petri-plate and allowed to solidify; this is 
the base layer of the test plate. The remaining portion of growth agar 
is further cooled and inoculated with a known volume of verified test 
organism. This inoculated agar is thoroughly mixed, poured onto the 
cooled base layer and allowed to solidify.
Once the agar solidifies (either single layer or bi-layer agar plate), stainless 
steel penicylinders are applied to the agar surface using a penicylinder 
dispenser. Penicylinders are applied in an equidistant and upright fashion. 
Each penicylinder should be immediately dosed with two concentrations of 
antibiotic, the diluted unknown sample [U3] or the median reference standard 
(S3). Further, both antibiotics are dosed in equal volume into alternating 
penicylinders. See Diagram 2 for further details.

---