Pharmaceutical Microbiology Manual

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 52 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
Diagram 2. Example of plated and dosed penicylinders containing the diluted unknown 
sample and median reference standard. 6/19/17 MBB. 
After dosing, all plates prepared in one independent test run are incubated at 
the same time. As the plates incubate, the antibiotics diffuse through the agar, 
creating a zone of clearing below and around penicylinder perimeter; this 
clearing is referred to as the zone of inhibition (ZOI). The ZOI demonstrates 
the antibiotic activity of the diluted unknown sample [U3] and the median 
reference standard [S3]. See Diagram 3 for further details.
Diagram 3. Example of plated and dosed penicylinders on incubated plates 
showing zones of inhibition. 6/19/17 MBB. 

---

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 53 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
After the specified incubation time, the penicylinders are removed, 
decontaminated (i.e. autoclaved) and washed with soap and water. The 
penicylinders are then heat sterilized prior to re-use in test. The diameter of 
each ZOI is measured with a manual/automatic plate reader. ZOIs should only 
be measured by qualified laboratory personnel. ZOI measurements are taken 
with the use of a manual or automatic plate reader. Examples of a manual 
reader include a Fisher-Lily zone reader or manual/electronic calipers; manual 
reads require data entry (e.g. handwritten and/or electronic) onto hardcopy 
and/or into electronic logbooks and/or spreadsheets. Examples of automated 
plate readers include OMNICON or Trinity V3. Unlike manual reads, 
automated plate readers allow a computerized system to measure the plates 
and do not require data entry of raw data.
Diagram 4. Example of a plated diluted unknown sample and median 
reference standard exhibiting equivalent ZOI diameters. 6/19/17 MBB. 
The zones of inhibition exhibited by the unknown sample [U3] and the median 
reference standard [S3] should be approximately equivalent. See Diagram 4 
for further details. The ZOI comparison between the diluted unknown [U3] and 
the median reference standard [S3] can be described mathematically as the 
percentage of reference concentration. The calculated potency of the unknown 
sample [U3] must have a percentage of reference concentration of 80% - 
125%. If the concentration of the diluted unknown sample [U3] falls outside this 
range of 80%-125%, the same unknown sample must be retested using an 
estimated dilution to obtain an equivalent concentration of the median 
reference standard [S3]. Diluting the unknown sample [U3] in this manner 

---