Ўзбекистон республикаси олий ва ўрта махсус таълим вазирлиги тошкент кимё технология институти биотехнология кафедраси

4-МАВЗУ. G’O‘ZA O‘SIMLIGI XUJAYRASIDAN YADRO AJRATIB OLISH USLUBI.


Material va asbob uskunalar. 50 g ikki kunlik g‘o‘za o‘simtasi, 100 ml 70% cpirt, 1 metr kapron, gomogenizator, K-23, K-32 sentrifugalari probirkalari bilai, 2 ta stakan, 2 ta kolba.


Ishning borishi. 50 g 2-kunlik g‘o‘za o‘simtasi 70% spirtda 2 daqiqa saqlangandan so‘ng distillangan suvda yuviladi. SHy yo‘sinda sterillangan g‘o‘za o‘simtasiga 150 ml A buferi solinadi va 30 sek. davomida yuqori aylanishga ega bo‘lgan (25000-30000 ayl/daq) o‘tkir pichoqli gomoginizatorda Maydalanadi. Gomogenat 4 qavatli sterillangan kapron yordamida fil’trlanadi va xujayra bo‘laklarini olib tashlash uchun 10 daqiqa 4⁰S xaroratda 600 ayl./dav; tezlikda K-23, sentrifugasida aylantiriladi va cho‘kma tashlab yuboriladi. Supernatant 1800 ayl/daq. to‘zlikda 10 daqiqa, 4⁰S haroratda K-23 ssntrifugasida aylantiriladi. CHo‘kma 10 ml B buferi suspenziya holatiga keltiriladi va qatlamli saxaroza (1,6; 2,2 M) gradientining yuqori qismiga ehtiyotkorlik bilan quyiladi. Saxaroza eritmasi V buferi yordamida tayyorlanadi: hosil qilingan gradient 22000 ayl/daq. tezlikda 4⁰S haroratda 2 soat K-32 sentrifugasida aylantiriladi (baket rotorda) cho‘kmada shikastlanmagan funksional faol yadro joylanadi.
Bufer eritmalar:

• 
  Bufer A: 0,4 M mannit; 50 mM tris-HCl, rN 8,0; 3 mM EDTA; 0,1 % Albumin (xayvon zardobidan olingan); 1% PVP ; 1 mM oktanol
  
• 
  Bufer B: 50 mM tris - HCl, pH7,5; 10 mM NaCl₃; 10 mM MgCl₂.
  
• 
  Bufer V: 50 mM tris - HCl, rN 7,5; 25 mM NaCl; 10 mM MgCl₂.
  

5-МАВЗУ:ПРОТОПЛАСТЛАР ОЛИШ УСУЛЛАРИНИ ЎРГАНИШ
Ўсимликлардан протопластлар олиш
1960 йилда Коккинг ўсимлик хужайра деворига гидролитик ферментлар билан ишлов бериб эритиш орқали изоляцияланган протопластларини ажратган. Протопластлар сунъий озуқа мухитларда ўстирилганда хужайра девори қайта тикланади ва одатдаги in vitro ўсаётган хужайралар каби бўлина бошлайди, колониялар хосил қилади ва бутун ўсимлик регенерацияланади.
Изоляцияланган протопластлар атрофидаги эритмадан макромолекула ва оргонеллаларни ютиш хусусиятига эга. Шу хусусияти туфайли ва шунингдек протопластларнинг қўшилиши, уларда меристематик фаолликнинг қўзғалиши ва бутун ўсимликнинг регенерацияланиши имконияти туфайли, изоляцияланган протопластлар ген мухандислиги объекти сифатида ҳамда ўсимлик хужайрасининг модификацияси учун фойдаланилади. Улар ёрдамида ўзаро чатишмайдиган узоқ турларнинг соматик дурагайлари, шунингдек хужайрасига ёт геном ёки геномнинг бир қисми киритилган ўсимликларнинг янги шакллари олинади. Энг самарали услублардан бири протопластларга геномнинг касалликларга чидамлилик хосил қилувчи бир қисмини киритилишидир.
Изоляцияланган протопластлар олиш учун бошланғич материал сифатида барг мезофили, ёки каллус тўқимасидан фойдаланиш мумкин.