«Ихтирога патент олиш: Ўзбекистон Республикасида унинг ҳуқуқий муҳофазаси ва ҳимояси» қўлланмасига

ИХТИРО ФОРМУЛАСИ
ACETOBACTER METHYLOVORANS ВСБ-914 АЦИДОФИЛ МЕТИЛОТРОФ БАКТЕРИЯЛАРИ ШТАММИ - БИОМАССА ПРОДУЦЕНТИ

Acetobacter mathilovorans ВСБ-914 ацидофил метилотроф бактериялар штамми (саноат микроорганизмларининг марказий музейида ЦТПМ В-2479 рақами остида депозит­ланган) - биомасса продуценти.

РЕФЕРАТ
ACETOBACTER METHYLOVORANS ВСБ-914 АЦИДОФИЛ МЕТИЛОТРОФ БАКТЕРИЯЛАРИ ШТАММИ - БИОМАССА ПРОДУЦЕНТИ


Фойдаланиш соҳаси: микробиология саноати.
Вазифаси: ацидофил метилотроф бактерияларининг юқорироқ температурада ривожлана оладиган янги штамми селекциясини яратиш.
Ихтиро моҳияти: биомасса продуценти бўлган Acetobacter methylovarans ВСБ-914 метилотроф бактерияларининг метанолли муҳитларда баланд температурада (39°С гача) ва рН муҳитининг паст қийматларида (3,0-6,0) биомассанинг метанолга чиқиши пасаймаган ҳолда ривожлана оладиган янги штамми таклиф этилди. Acetobacter methylovarans ВСБ-914 метилотроф бактерияларининг таклиф қилинаётган штамми ностерил шароитларда рН 3,0-3,3 да, 38°С температурада метанолнинг термотолерант ачитқилар штамми билан ферментация жараёнида ҳосил бўлган спонтан микроб комплексидан ажратиб олинган ва ке­йин метанолли суюқ муҳитларда баланд температура ва рН нинг паст қийматларида узоқ пасталаш жараёнида селекция қилинган.

6-мисол

Ихтиро объекти - МОДДА ВА УНИ ОЛИШ УСУЛИ

МПК⁷ А61К38/02

МУДДАТИ УЗАЙТИРИЛГАН ТРОМБОЛИТИК ВОСИТА ВА УНИ ОЛИШ УСУЛИ

Ихтиро тиббиёт соҳасига мансуб бўлиб, тромбоэмболик касалликлар терапияси учун мўлжалланган фибринолитик ферментларнинг янги ацилаланган ҳосилаларини ифодалайди.

Қон томирларига тромб тиқилиб қолиши билан боғлиқ бўлган тромбозлар ва тромбоэмболиялар инсондаги юрак-томир касалликларининг ўлим билан тугалланиши мумкин бўлган энг кенг тарқалган ва оғир асоратларга олиб келадиган турларидан биридир. Тром­боэмболик касалликлар терапияси тромболитик агентларни юбориш билан олиб бори­ладики, булар томир ичидаги қуйилиб қолган қоннинг эришини келтириб чиқаради. Тром­болитик агентларга қуйидагилар киради: тромб фибринини бевосита аста-секин пасай­тирадиган протеолитик ферментлар (плазмин, бриназа ва ҳ.к.) ва эндоген плазминогенни плазмага айлантирадиган плазминоген активаторлари (урокиназа, стрептокиназа, плазми­ногеннинг тўқимавий активатори ва проурокиназа), аста-секин пасаювчи тромб.
Сўнгги ўн йилликларда клиникаларда асосан эски авлод плазминоген активаторлари қўлланиб келди: инсон сийдиги ёки буйрак хужайраларининг культурал суюқлигидан ажратиб олинадиган урокиназа ва гемолитик стрептококклар секрециясининг маҳсулоти бўл­ган стрептокиназа. Бироқ урокиназанинг ҳам, стрептокиназанинг ҳам фибринга махсус яқинлиги йўқ. Шунинг учун плазминогеннинг терапевтик самарага эришиш учун зарур бўлган катта дозалардаги иккала активатори нафақат тромбда, балки циркуляцияда ҳам плазминогенни плазминга айлантиради. Бу уларнинг фибриногеннинг емирилиши, плазминоген ва альфа-2-антиплазминнинг тугаб бориши ва б. каби гемостаз ҳолатига каттагина қўшимча таъсир­ларини юзага келтиради.
Сўнгги йилларда тромбозлар терапиясида янги авлод тромболитик агентлари қўллана бошланди. Улардан бири тўқима туридаги плазминоген активатори бўлиб, у инсон меланом хужайраларининг культурал суюқлигидан (Collen D.J., Rijken D., Matsuo O.// Eur.Pat.Appl., 1981, Int.Cl. C 12 № 9/64, A 61 K 37/54) ҳамда ген инженерияси усули (Pennica D., Holmes W.E., Kohr W.J., Harkins R.N., Vehar G.A. et al.// Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. Coli. Nature, 1983, V.301, P.214-221) билан олинади.
Плазминоген тўқимавий активаторининг фибринга анча яқинлиги бор. Бироқ у, стрептокиназа ва урокиназага ўхшаб, циркуляциядан тез чиқариб юборилади: инсон плазмасида стрептокиназанинг нимҳаёт вақти 18 минутни, урокиназаники 16 минутни ва плазминоген тўқимавий активаториники 9 минутни ташкил қилади. Бу уччала активатордаги қон оқимидан клиренснинг тезлиги катта бўлганлиги сабабли, уларнинг даволаш дозасини кўп соатли инфузия йўли билан юбориш мураккабдир. Активаторларни мунтазам киритиш йўли билан беморни узоқ муддат даволаш фибринологик тизимни рағбатланти­риб юборади, бунинг оқибати ўлароқ фибриногеннинг емирилиши туфайли ҳавфли қон ке­тишлар содир бўлади ҳамда бемор плазминоген камайиб кетиши натижасида ретромбоз­ларга берилувчан бўлиб қолади.
Янги авлод тромболитик агентининг бошқа бир вакили бу плазминогенстертокиназа активатор мажмуининг актив марказ бўйича ацилланган хосиласи - анизоил-плазминоген стрептокиназа активатор мажмуи (APSAC, «Eminase, BRL921, Beecham Phapmaceutical, Great Britain») («Smith R.A.G. // Eur. Pat. Appl., 1980, N 0009879, Int. CI. A 61 K 37/48, C 12 N 9/68») бўлиб, у даволаш амалиётида борган сари кенг қўлланиб келмоқда. Актив марказ бўйича қайтарилувчан инактиваторланган активатор мажмуаси фибринга яқинлигини сақлаб қолади ҳамда антиплазмин уни реактивациягача протеолиз ва инактивациядан ҳимоялайди. Активатор мажмуаси қон оқимида ҳам, APSAC тромбида ҳам маълум тезликда реактивацияланадики, бу унга бошқа тромболитик агентлардан фарқлаб турадиган қуйи­даги афзал сифатлар бахш этади: таъсир муддатининг катталиги ва юборилиш осонлиги каби. У, артериал босимни пасайтирмай туриб, болусли, бир мартали инъекция кўрини­шида юборилиши мумкин. Бошқа барча маълум активаторларга қараганда, APSAC инсон плаз­масида энг катта нимҳаёт даврига эга: 90 минут (Ferres H. // Preclinlcal pharmacjlogical evalution jf anisoylated plasminogen-streptokinase activator complex. Drugs. V.33, (Supp.3), P.33-50).
Бироқ APSAC нинг терапевтик дозаси (30 мг бўлиб, бу 1500000 I.U. стрептокиназага эквивалентдир) циркуляцияда плазминогеннинг стрептокиназа билан солиштирса бўладиган активациясини келтириб чиқаради ва плазминемияни ривожлантиради (Сollen D.// Coronary thrombolysis: Streptokinase or recombinant tissue-type plasminogen activator.// Annals of Internal Medicine, 1990, V.112. P.529-538). Циркуляцияда каттагина миқдордаги эркин плазминнинг ҳосил бўлиши фибриногеннинг, V ва VIII омилларнинг протеолизига, альфа-2-антиплазмин даражасининг пасайишига ва бошқа ҳодисаларга олиб келади. Геморрал асоратларнинг ривожланиши билан ҳавф туғдирадиган ушбу ҳодисалар қонда дастлаб каталик инерт ацилактиваторли мажмуанинг анча юқори тезликдаги реактивацияси туфай­ли келиб чиқади. Бунинг натижасида APSAC фақатгина шошилинч терапияда ўткир мио­кард инфарктини даволашда қўлланади, чунки бунда эрта перфузия афзал кўрилади, пре­паратнинг бошқа қўшимча ҳодисаларидан эса кўз юмишга тўғри келади. APSAC нинг фи­бринолизга кўрсатадиган мунтазам активацияловчи таъсири билан боғлиқ геморрогик асо­ратларнинг юқори частотаси ундан периферия артериялари ва томирларидаги тромбозлар­ни даволаш учун фойдаланиш имконини бермайди.
Ихтиро вазифаси асосан тромб соҳасида узоқ вақт давомида амал қиладиган ҳамда тизимли циркуляцияда фибринолиз ҳолати ва фибриноген таркибига катта таъсир кўрсатмайдиган тромболитик воситани яратишдан иборат.
Бу вазифани янги бирикмалар, хусусан умумий формуласи

бўлган фибринолитик ферментларнинг 4-(N,N,N,-триметиламино)-циннамониал ҳосилалари ҳал қилиб беради. Бу ерда Е - урокиназа, плазминогеннинг т ўқимавий активатори, плазмин, плазминстрептокиназнинг активатор мажмуаси, плазминогенстрептокиназнинг активатор мажмуаси, бу ерда 4-(N,N,N,-триметиламино)-циннамониал гуруҳи (4-ТМАЦ) фермент актив марказининг серини билан қўшилган.

4-ТМАЦ-ферментлар, ўзларининг 4-анисолли ҳосилаларига қараганда, секинроқ реактивацияланади. Масалан, 2-мисолда тавсифланганидек олинган транс-4-ТМАЦ-плазминстрептокиназа активатор мажмуаси ва 4-анисоил-плазминстрептокиназа активатор мажмуаси изотоник сувли муҳитда (pH 7,4, 37°С) мос равишда 58 минут ва 29 минут реактивациялаш яримдаври билан реактивацияланади, уларнинг инсон қони плазмасидаги ним­ҳаёт вақти мос равишда 136 минут ва 72 минутга тенг.
Таклиф қилинаётган ацилактиватордан кутилаётган терапевтик самара қуйидагича: қон оқимидаги катта турғунлик, тромболитик таъсирнинг узоқ вақт давом этиши ва APSAC га қараганда қўшимча ҳодисалар қийматининг камлиги. Тизимли ҳодисаларнинг кам ифодаланганлиги туфайли, таклиф қилинаётган ацилактиватордан периферик қон томирлари тромбозларини даволаш учун, шунингдек ўткир миокард инфарктини индивидуал равишда ёки клиник ҳолатдан келиб чиқиб стрептокиназа билан қ ўшиб даволаш учун фойдаланиш мумкин.
ТМАЦ-ҳосила ферментларини олиш усули шундан иборатки, бунда фибринолитик фермент актив марказ бўйича 4-нитрофенил эфири цис- ёки 4-(N,N,N,-триметиламино)-долчин кислотаси трансизомерлари билан ацилланади. Ациллаш 0-25С температурада ва pH 7,0-8,5 да 10-70 минут давомида органик эритгичсиз ўтказилади. Сўнгра олинган ацилфермент таъсирга киришмаган ацилацияланаётган агентдан ва ҳосил бўлган 4-нитрофенол эфиридан гельфильтрация йўли билан ажратиб олинади ва оқсилли фракциялар лиофил­лаштирилади.
Ихтиро қуйидаги мисолларда таърифланади.
1-сонли мисол.
Транс-4-ТМАЦ-плазминни олиш.
Инсоннинг 9 мл 15 мкМ плазмини эритмаси (М.В. 85000Д, _макс=280 нм, Е^1%_1см=17) га таркибида 0,15 М NaCI бўлган рН 8,5 нинг 0,1 М трис-HCI буферида 1 мл миқдорида транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотасининг 10мМ эритмали-4-нитрофенил эфири (C₁₈H₁₉JN₂O₄, M.B. 454D, Т_пл=190C, _макс=278 HM, є_макс=2,38-10⁴ М^-1см^-1) HCI pH 3,0 да қўшилади ҳамда 10 минут давомида 25С да инкубация қилинади. Ферментга 5 минут давомида ацелациялаш агенти билан қ ўшимча ишлов берилганидан кейин, реакциялаш қоришмаси G-25 сефадексли колонка устига берилади. Элюент сифатида 0,075 М NaCI (4С) эритмаси ишлатилади.Оқсилли фракциялар лиофиллаштирилади. Таркибида 2,8% ацилплазмин бўлган оқсилли кукуннинг чиқиши 0,33 г. Олинган 4-ТМАЦ-плазмин (M.B. 85 300D, _макс=272 HM) 1-1,5 % миқдорида эркин фермент қоришмасига эга ҳамда изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) да актив плазмин Сv₂ = 82 мин га реактивация қилиниши мумкин.
2-сонли мисол.
Транс-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активатор мажмуасини олиш.
Инсоннинг 4,5 мл 11,8 мкМ плазминоген эритмаси (М.В. 85000Д, _макс=280 нм, Е^1%_1см=17) га таркибида 0,15 М NaCI бўлган рН 8,0 нинг 0.05 трис-HCI буферида стрептокиназа (М.В. 47000Д, _макс=280 нм, Е^1%_1см=10) навескаси (300 000 I.U) қўшилади ҳамда қоришма 15 минут давомида 25С да инкубация қилинади. Плазмин-стрептокиназа активатор мажмуасининг ҳосил бўлиш жараёни S-2251 0,6 мМ қоришмаси гидролизининг тезлиги бўйича кузатиб борилади. Активатор мажмуасига 40 минут давомида 25С да транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотаси (охирги концентрацияси 0,1 мМ) нинг 4-нитрофенил эфири эритмаси билан ишлов берилади. Кейин эритма гельфильтрация қилинади ҳамда оқсил фракциялар 1-сонли мисолда тавсифланганидек лиофилланади. Қаттиқ кукуннинг чиқиши 0,25 г., мақсадли маҳсулот таркиби 2,5%. Олинган транс-4-ТМАЦ-плазминстрептокиназа активатор мажмуи (M.B. 132 300D, _макс=272 нм) изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) Сv₂ = 58 мин да реактивация қилинади.
3-сонли мисол.
Транс-4-ТМАЦ-плазмин ва транс-4-плазминострептокиназа қоришмаси активар мажмуасини олиш.
3 мл 25 мкМ плазминогенга таркибида 0,15 М NaCI бўлган рН 8,0 нинг 0.1 М трис-HCI буферида 3 мл стрептокиназа эритмаси (71 500 I.U//мл) қўшилади ҳамда 10 минут давомида 25С да инкубация қилинади. Фермент ва активар мажмуанинг ҳосил бўлган қоришмасига 30-40 минут давомида 25С да HCI pH 3,0 да транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотасининг 4-нитрофенил эфири 10 мМ эритмаси билан ишлов берилади ва кейин 1-сонли мисолда тавсифланганидек иш тутилади. Қаттиқ кукуннинг чиқиши 0,39 г. Олинган транс-4-ТМАЦ-плазмин ва транс-4-плазминстрептокиназа қо­ришмаси (M.B. 132 300D, _макс=272 нм) 2-7 % ацилланмаган ферментларга эга ҳамда изо­тоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) да 6 соат давомида актив фермент ва актив мажмуага реактивация қилиниши мумкин.
4-сонли мисол.
Цис-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активатор мажмуасини олиш.
2-сонли мисолда тавсифланган усул билан цис-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активар мажмуаси олинади. Ацилациялаш агенти сифатида охирги концентрацияси 0,1 мМ бўлган _макс=278 HM, є_макс=2,38-10⁴ М^-1см^-1) цис-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотасининг 4-нитрофенил эфири эритмасидан фойдаланилади. Ацелациялаш реакцияси 70 минут давомида олиб борилади. Кейинчалик 2-сонли мисолда тавсифланганидек иш тутилади. Қаттиқ кукуннинг чиқиши 0,27 г., мақсадли маҳсулот таркиби 1,2%. Олинган транс-4-ТМАЦ-плазмин-стрептокиназа активатор мажмуи (M.B. 132300D, _макс=265 нм) 10-15% ацилланмаган мажмуага эга ҳамда изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) да 5 соат давомида реактивация қилиниши мумкин.
5-сонли мисол.
Транс-4-ТМАЦ-плазминоген-стрептокиназа активатор мажмуасини олиш.
Таркибида 0,15 М NaCI бўлган рН 7,0 нинг 0.05 трис-HCI буферида стрептокиназа (57200 I.U./мл) ва плазминоген (10 мкМ) бўлган эритмага охирги концентраияси 0,1 мМ бўлган транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотасининг 4-нитрофенил эфири эритмаси қўшилади ҳамда 60 минут давомида 4С да инкубация қилинади. Кейин эритма гельфильтрацияга учрайди ҳамда ҳамда оқсил фракциялар 1-сонли мисолда тавсифланганидек лиофилланади. Қаттиқ кукуннинг чиқиши 0,88 г., ацилактиватор таркиби 2,1%. Олинган транс-4-ТМАЦ-плазминоген-стрептокиназа активатор мажмуаси (M.B. 132 300D, _макс=272 нм) 5-10% ацилланмаган мажмуага эга ҳамда изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) сv₂ = 58 мин да актив мажмуага реактивация қилиниши мумкин.
6-сонли мисол.
Тўқима туридаги плазминогеннинг транс-4-ТМАЦ-активаторини олиш.
Таркибида 1 мг/мл фермент бўлган тўқимали плазминоген активаторининг 1 мл эритмасига таркибида 0,15 М NaCI ва транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотаси (10 мМ) нинг 0,2 мл миқдоридаги 4-нитрофенил эфири заҳиравий эритмаси қўшилади ҳамда 10 минут давомида 25С да инкубация қилинади. Ферментга 3-4 минут давомида 0,1 мл ациллаш агенти билан такроран ишлов берилгач, эритма сефадекс G-25 да 4 С да гельфильтрация қилинади. Оқсилли фракциялар музлатиб қўйилади ҳамда 40С да сақланади, т ўқима туридаги плазминогеннинг транс-4-ТМАЦ-активатори (M.B. 66 300D, _макс=272 нм) изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) актив ферментга реактивация қилиниши мумкин.
7-сонли мисол.
Транс-4-ТМАЦ-урокиназани олиш.
1 мл (25 000 I.U./мл) урокиназа эритмаси (М.В. 54000Д, _макс=280 нм, Е^1%_1см=13,6) га рН 8,5 нинг 0.05 М трис-HCI буферида охирги концентрацияси 1 мМ бўлган транс-4-(N,N,N-триметиламино)-долчин кислотасининг 4-нитрофенил эфири эритмаси қўшилади ва 30-40 минут давомида 25С да инкубация қилинади. Ацилациянинг бориш жараёни фермент экстераза активлигининг тушиб кетиши бўйича кузатиб борилади, бунда ацетилглициллизин метил эфирининг 6 мМ эритмаси гидролизининг тезлиги рН-статда аликвоталар таъсири остида ўлчаб турилади. Ҳосил бўлган ацилфермент 6-сонли мисолда тавсифланганидек ажратиб олинади. Олинган транс-4-ТМАЦ-урокиназа (M.B. 543300D; _макс=272 нм) 104% ацилланмаган ферментга эга б ўлади ҳамда Сv₂ = 18 мин изотоник сув муҳити (рН 7.4; 20 фоизли глицерин; 37С) да реактивация қилинади.
8-сонли мисол.
Ацилактиваторларнинг фибринолитик активлиги.
0,9 мл инсон қони плазмасига 4 Ед/мл концентрациясигача хўкиз тромбини эритмаси қўшилади, 1-1,5 соат сақлаб турилади ҳамда 0,5 мл инсон плоазмаси қуйқаси устида жойлаштирилади. Қуйқа устидаги плазмага 2-сонли мисол бўйича олинган 10 мкл стрептокиназа, плазминстрептокиназа активатор мажмуаси, 4-4ТМАЦ-плазминстрептокиназа активатор мажмуаси ёки 4-анисоилплазмин стрептокиназа активатор мажмуасининг эритмаси 41 мкМ охирги концентрациясигача қўшилади, 37С да инкубацияланади ҳамда фибрин қуйқаси устуни баландлигининг (₁) вақтдан камайиши ўлчанади. Фибринолиз тезлиги ₁ нинг _t га тобеликларининг эгилиш бурчаги тангенси сифатида аниқланади. Транс-4-плазминстрептокиназа активатор мажмуасиси томонидан плазмага ботирилган плазма қуйқалари фибринолизининг тезлиги стрептокиназа ёки плазминстрептокиназа эркин мажмуасидагига қараганда анча юқори ҳамда 2-сонли мисол бўйича олинган 4-ани­соил-плазминстрептокиназа активатор мажмуасидагига қараганда хиёл пастроқ (жадвал).

1-жадвал
Турли плазминоген активаторлари билан инсон плазмасига ботирилган плазма қотмалари лизинининг тезлиги

Плазминоген активатори	Фибринолиз тезлиги, 1/t (мм/мин)
1. Стрептокиназа	5,0х10^-3
2. Плазминстрептокиназа активатор мажмуаси	13,310^-3
3. Транс-4-ТМАЦ-плазминстрептокиназа активатор мажмуаси	19,8х10^-3
4.4-анисоилплазсинстрептокиназа активатор мажмуаси	22,9х10^-3