Методика проведения лабораторных анализов в свп, их клинико-диагностическое значение

Взятие биоматериала. Забор крови из вены производят натощак шприцем в сухую центрифужную пробирку в количестве 2,0-3,0 мл. Кровь оставляют на 10 мин, затем иглой осторожно отслаивают содержимое пробирки от стенок. Центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин. Берут сыворотку в отдельную пробирку. Сыворотка может храниться в замороженном состоянии 1 мес. Для анализа используют 0,5 мл сыворотки.
Ход работы. Для определения активности АЛАТ берем две пробирки: № 1 – опыт, № 2 – контроль. В опытную и контрольную пробирки добавляют по 3,0 мл субстратно-буферного раствора, по 0,05 мл НАДН – раствора и по 0,1 мл суспензии ЛДГ. В опытную пробирку прибавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,05 мл 154 ммоль/л раствора NaCl. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при температуре 37° С на 10 мин. Затем в пробирки № 1 и 2 добавляют по 0,1 мл раствора α-кетоглутаровой кислоты и на спектрофотометре через равные отрезки времени (1, 2 и 3 минуты) измеряют экстинкции опытной и контрольной пробирок против воды при длине волны 340 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см. Перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1. Определение проводят по следующей схеме (табл.).


Определение активности АЛАТ

Реактивы	Опытная проба, мл	Контрольная проба, мл	Конечная концентрация вещества в пробе
Субстратно-буферный раствор	3,0	3,0	Фосфатный буфер – 80 ммоль/л
НАДН-раствор	0,05	0,05	500 ммоль/л
ЛДГ	0,1	0,1	0,18 ммоль/л
Сыворотка крови	0,5	-
154 ммоль/л раствор NaCl	-	0,05	20 000 нмоль/(с ∙ л)
Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин при температуре 30 или 37 ^0С
Раствор α-кетоглутаровой кислоты	0,1	0,1	15 ммоль/л

После инкубации через 60 с (лаг-фаза) измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию.

Измерение опытной и контрольной проб проводят против воды при 340 нм в кювете с толщиной слоя в 1 см.