Методика проведения лабораторных анализов в свп, их клинико-диагностическое значение

КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ (АЛАТ) В КРОВИ

Метод определения АЛАТ основан на катализируемом ферментном превращении L-аланина в пируват, в процессе восстановления которого лактатдегидрогеназой (ЛДГ) происходит расходование НАД ∙ Н:

АЛАТ

1
ЛДГ
) 2-оксоглутарат + L – аланин L-глутамат + Пируват;
2 ) Пируват + НАД ∙ Н + Н ⁺ L-лактат + НАД⁺.
Снижение концентрации НАДН, отражаемое уменьшением оптической плотности раствора в ультрафиолетовой области, пропорционально активности АЛАТ. Содержащийся в пробах эндогенный пируват быстро и полностью восстанавливается присутствующим в реагенте ферментом ЛДГ во время начального периода инкубации («лаг-периода»), так что это не влияет на результат анализа.
Материал исследования: сыворотка крови.
Оборудование: спектрофотометр, термостат, центрифуга, холодильник, кюветы с толщиной слоя 1 см, колбы вместимостью 100 мл, пробирки, пипетки на 5 и 10 мл, микропипетки на 0,1 мл.
Необходимые реактивы:

1. 
   Калия фосфат однозамещенный (КН₂РО₄).
   
2. 
   Калия фосфат двузамещенный (К₂НРО₄ ∙ 3Н₂О).
   
3. 
   Фосфатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещенного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного фосфата калия растворяют в 40-60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике.
   
4. 
   L-альфа-аланин.
   
5. 
   Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L-аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4: 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл. Стабилен в течение 2 месяцев при хранении в холодильнике.
   
6. 
   β-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л (коэффициент молярной экстинкции не ниже 5,6 ∙ 10² м² ∙ моль^-1 при 340 нм): 16 мг НАДН ∙ Na₂ ∙ 4H₂O растворяют в 1,5 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в темной посуде в холодильнике.
   
7. 
   Натр едкий, 5 моль/л.
   
8. 
   α-кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л: 0,245 г α-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют динатриевую соль α-кетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.
   
9. 
   Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50%-ном растворе глицерина. Специфическая каталитическая активность выше 8 ммоль/(с ∙ л). Примеси: АСАТ < 0,01 % ГлДГ <0,003 %, АЛАТ < 0,01 %. Для приготовления рабочего раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике.
   
10. 
    Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологический раствор). Все реактивы лучше готовить на бидистиллированной воде.