Statik biokimyо

43-tajriba. Engelgard va Smirnova usuli bilan kalorimetrik usulda
xolesterin miqdorini aniqlash. 
Sog‘lom kishilarning qonida xolesterinning bir qismi eritrotsitlarda, ikkinchi qismi esa 
qon plazmasida bo‘ladi. Eritrotsitlardagi xolesterin erkin holda, plazmadagi xolesterin esa efir 
shaklidadir. Qondagi xolesterinning umumiy miqdori me'yorida 150-200 mg % bo‘ladi. Ushbu 
usulda xolesterin miqdorini aniqlashda uning efirlari gidrolitik parchalanadi.
Ayrim kasalliklar, jumladan diabet, ba'zi bir buyrak va mexanik sariq kasalliklarida 
qondagi xolesterinning miqdori 1000 mg % ga yetadi. Aksincha, jigarning ba'zi bir 
kasalliklarida, shuningdek, kamqolilik va buyrak usti bezi xastaligida qondagi xolesterin miqdori 
kamayadi. Shuning uchun ham qondagi xolesterin miqdorini aniqlash muhim ahamiyatga ega. 
Kerakli jihozlar va reaktivlar: Probirkalar (qalin shishadan yasalgan), o‘lchovli probirka 
(2 dona), mikropipetka, kalorimetr, suv hammomi, pipetka (5 ml li), Frank ninasi yoki 
skarifikator, paxta, doka, kaliy ishqorining (KON) 25 % li eritmasi, natriy monogidrofosfat 
Na
2
HPO
4
· 2H
2
O, atsetat angidrid, sulfit kislota (konsentrik), xolesterinning xloroformdagi 20 
mg % li standart eritmasi. 
Ishning bajarilishi: 
Buning uchun xolesterinning atsetat angidrid bilan yashil rang hosil qilish reaksiyasidan 
foydalaniladi. Ana shu rangning intensivligi asosida kolorimetrik usul bilan xolesterin miqdori 
aniqlanadi.
Rangning intensivligini solishtirish uchun Dyubosk tipidagi kolorimetrdan foydalaniladi.
Kalorometr asbobida 2 ta stakancha bo‘lib, ular siljiydigan maxsus kursichalarga 
o‘rnatilgan. Vintlar yordamida stakanchalarni yuqori ko‘tarish va pastga tushirish bilan ularga 
quyilgan rangli suyuqliklarning qalinligini o‘zgartirish mumkin. 
Asbobning pastki qismidagi plastinkaga tushgan yorug‘ tekshiriladigan rangli suyuqlik va 
shisha tayoqchalardan o‘tib, maxsus prizmaga (V) tushadi. Prizmadan o‘tganda o‘ng tomondagi 
yorug‘ okulyarning chap tomonida va chap tomondagi yorug‘ okulyarning o‘ng tomonida 
ko‘rinadi.

---

Kolorometr bilan ishlashdan avval uni tekshirib ko‘rish kerak. Buning uchun asbobning 
ikkala stakanchasiga bir xil konsentratsiyali rangli suyuqlik solinadi. So‘ng stakanchalarni 
asbobdagi joyga o‘rnatib, tegishli vintlar yordamida bir xil qalinlikka to‘g‘irlanadi. Shundan 
keyin plastinkani yorug‘ tomonga qaratib, okulyardan qarab ikki tomondagi rangning bir xil 
bo‘lgani topiladi.
Shundan so‘ng asbobni va plastinkani qimirlatmasdan stakanchalardagi suyuqlik to‘kib 
tashlanadi, stakanchalar yuvilgandan keyin biriga standart, ikkinchisiga tekshiriladigan suyuqlik 
solinadi. Standart eritmali stakan asbobning chap tomoniga va tekshiriladigan suyuqlik o‘ng 
tomoniga o‘rnatiladi. Vint yordamida standart eritmani ma'lum qalinlikda (10-15 mm) qo‘yib, 
o‘ng tomondagi vint yordamida tekshiriladigan suyuqlikni yuqoriga ko‘tarish va pastga tushirish 
bilan okulyardagi rangning bir xil bo‘lgani topiladi (tayoqchalarning uchi albatt suyuqlikka botib 
turishi shart). So‘ngra shkaladan standart va tekshiriladigan suyuqliklarning qalinligi aniqlanadi. 
O‘ng tomondagi suyuqlikning qalinligini o‘zgartirib, qaytadan okulyarda ko‘ringan rangning bir 
bo‘lganini topib, shkaladan suyuqliklarning qalinligi aniqlanadi. Shu xilda suyuqliklarning 
qalinligi 2-3 marta aniqlanadiva o‘rtachasi olinadi. Shundan keyin tekshirilgan suyuqlikdagi 
modda miqdori formula yordamida hisoblab topiladi.
Barmoqdan mikropipetka bilan 0,1 ml qon olib, sentrifuga probirkasining eng tagiga 
tushiriladi. Qon olingan pipetka bilan distillangan suvdan 0,1 ml olib qonga qo‘shiladi. Yana shu 
pipetka bilan kaliy ishqorining 25 % li eritmasidan 0,1 ml olib, u ham shu probirkaga solinadi. 
Shundan keyin probirka qaynab turgan suv hammomida 30 minut saqlanadi. Natijada yuqori 
harorat ta'sirida va ishqor ishtirokida qondagi xolesterin efirlari gidrolitik usulda xolesterin va 
yog‘ kislotasiga parchalanadi.
Mo‘ljallangan vaqt o‘tgach probirkaga 1,5 ml xloroform 0,15 g chamasida natriy 
gidrofosfat kukuni solinadi va shisha tayoqcha bilan aralashtiriladi. So‘ng 10 minut tinch 
saqlanadi. Ko‘rsatilgan vaqt o‘tgach probirka to undagi xloroform qaynaguncha qaynab turgan 
suv hammomiga qo‘yiladi va sovuq suvda sovitiladi. Gidrofosfat gigroskopik bo‘lgani uchun 
probirkadagi suvning hammasini o‘zida olib qoladi va suvsiz xloroform ajraladi. Qondagi 
efirning gidrolizlanishidan hosil bo‘lgan xolesterin va erkin xolesterinning hammasi shu suvsiz 
xloroformda erigan bo‘ladi. Probirkadagi xloroform dekantatsiya usulda 2,5 ml li probirkaga 
quyiladi. Qotgan tuzda qolgan xolesterin qoldiqlari 1 ml xloroform bilan chayqatilib, o‘lchovli 
probirkadagi suyuqlik ustiga solinadi. Uning ustiga suyuqlikning hajmi 2.5 ml ga yetguncha 
xloroform qo‘shiladi. 
Shundan keyin ikkinchi bir 2,5 ml li probirkaga xolesterinning xloroformdagi 20 mg% li 
eritmasidan 1 ml olib, ustiga uning hajmi 2,5 ml ga yetguncha xloroform qo‘shiladi.
O‘lchovli probirkalarning ikkalasiga ham 1 ml dan atsetat angidri va 3 tomchidan 
konsentrik sulfat kislota qo‘shiladi va so‘ng chayqatiladi. 30 minut tinch saqlanadi. Natijada 
probirkalardagi suyuqlik yashil rangga buyaladi. 
Mo‘ljallangan 30 minut o‘tgach, probirkalardagi yashil rangli suyuqlikni kolorimetrning 
stakanchalariga qo‘yib, ularning rangi solishtiriladi. Shundan keyin quyidagi formula yordamida 
xolesterinning miqdori hisoblab chiqariladi.