Vazirligi termiz agrotexnologiyalar va innovatsion riv ojlanish instituti

Reagentlar
Miqdori
1.	Planshetlar, antigen shimdirilgan	5
2.	Musbat nazorat	2,0 ml
3.	Manfiy nazorat	2,0 ml
4.	Kon’yugat	55 ml
5.	Namunani suyultirish uchun bufer eritma	235 ml
6.	TMV substrat	60 ml
7.	Stop eritma	60 ml
8.	Yuvadigan konsentrat (10 kratniy)	235 ml

175




Qo‘yish tartibi.
Barcha komponentlami ishlatishdan oldin harorati 18-26⁰ C bo‘lgan joyga chiqarib qo‘yish lozim. Reagentlarni ishlatishdan oldin sekinlik bilan aralashtirib olish kerak. Har bir namunani aralashtirishda nakanenshniklarni almashtirish kerak.

1. 
   Planshetlarni tayyorlash va ularga yozish.
   
2. 
   Namuna qo‘yish ikki lunkaga K^- 100 mkl dan quyiladi.
   
3. 
   Namuna qo‘yishda ikkita lunkaga K+ 100 mkl dan quyiladi.
   
4. 
   Tayyorlangan zardobdan bir necha (2 yoki 3) lunkaga 100 mkl dan quyiladi.
   
5. 
   60 daqiqa (±5 daq.) 18-26⁰ C da saqlanadi, usti yopiq holda.
   
6. 
   Har bir lunkani 3-5 maratoba yuvish (taxm. 350 mkl eritma ketadi).
   
7. 
   Har bir lunkaga 100 mkl dan Konyugat (xren peroksidaza, antigen va antitelo bog‘lanishi uchun) quyiladi.
   
8. 
   30 daqiqa (±2 daq.) 18-26⁰ C saqlanadi.
   
9. 
   Yuvish jarayoni yana 6 marta.
   
10. 
    Har bir lunkaga 100 mkl dan TMVsubstrati quyib chiqiladi.
    
11. 
    15 daqiqa (±1 daq.) 18-26⁰ C saqlanadi.
    
12. 
    Har bir lunkaga 100 mkl dan Stop eritmadan quyib chiqiladi, reaksiyaning oxirgi bosqichi ya’ni to‘xtatish uchun.
    
13. 
    Spektrofotometrni to‘g‘rilab olish.
    
14. 
    Namunalarni 650 nm o‘lchamda olib boriladi. Ularning optik zichligini yozish.
    
15. 
    Natijalarni hisoblash.
    

1. 
   Maxsus immunoglobulinlar (immun zardobdan ammoniy sulfat bilan cho‘ktirib, keyin tozalab olinadi).
   
2. 
   Turga qarshi globulinlar (giperimmun zardobdan ammoniy sulfat bilan cho‘ktirib, keyin tozalab olinadi).
   
3. 
   Oqsil A (tilla rang stafilokokkdan olinadi) yoki ho‘kiz zardobi albumini.
   
4. 
   Antigen (zararlangan hayvonlar organlaridan tayyorlanadi). Oldindan Ma’lum bo‘lgan musbat va manfiy antigenlar.
   

176

5. 
   Peroksidaza fermenti (xrendan olinadi),
   
6. 
   Kon’yugat (periodatli oksidlanish usulida antitela yoki antigen bilan bog‘langan peroksidaza).
   
7. 
   Substratli aralashma (5- aminosalisil kislota va vodorod peroksidi yoki ortofenilyndiamin va vodorod perikisi).
   
8. 
   Detergent (sirtga faol moddalar: tvin - 20, - SO, triton X - 100, sorbital S-20).
   
9. 
   Immunologik planshet (shaffof polistiroldan tayyorlangan).
   
10. 
    Dozator (reaksiya ingridientlarini quyish uchun). Reaksiyani qo‘yishning bevosita va bilvosita usullari mavjud.
    

Amaliyotda asosan bilvosita usul qo‘llanadi.
Antigenni immunoferment usulida aniqlash. Reaksiyani qo‘yishdan avval, liofillangan komponentlar yorlig‘ida ko‘rsatilgan hajmda 0,01 M fosfatli bufer eritma yoki distillangan suv bilan eritiladi va ishchi eritma hajmiga yetkaziladi. Planshet o‘yiqchalariga bosqichma bosqich solinadigan komponentlar o‘zaro teng hajmda bo‘lib, 0,1 ml ni tashkil etadi.
Reaksiya bosqichlari:

1. 
   Planshetni sensibillash. Planshet o‘yiqchalariga maxsus antitelalar (immunoglobulinlar) yorlig‘ida ko‘rsatilgan ishchi eritmasi quyiladi. Planshet antitelalar bilan uch soat termostatda 37° C da qo‘yiladi. Keyin planshetlar tvinli fosfat buferi eritmasi bilan 3 - 4 marta yuviladi. Eritmaning qoldiqlari filtr qog‘ozga planshetni bir necha bor qoqib olinadi.
   
2. 
   Antigen quyish. Maxsus antitelalar bilan sensibillangan planshet o‘yiqchalariga nazoratli musbat va manfiy antigenlar hamda 1:10 dan 1:1280 nisbatgacha suyultirilgan sinovli namunani quyib, termostatda 37° C da 1 soat qo‘yiladi. Inkubatsiya muddati o‘tishi bilan planshet o‘yiqchalaridagi antitela bilan bog‘lanmay qolgan antigenlarni uch marta yuvib, filtr qog‘ozda quritiladi.
   
3. 
   Antigen + antitelo kompleksini aniqlash uchun suyultirmalarga turga qarshi perosidazali konyugatni quyish. Konyugat quyib chiqilgach planshetalar termostatga 37° C da 1 soat qo‘yiladi. Keyin o‘yiqchalarni uch marta tvinli fosfatli bufer bilan yuvib quritiiadi.
   

177

4. 
   Substratli aralashmani quyish. Reaksiya namoyon bo’lishi uchun planshet o‘yiqchalariga substrat eritmasi (peroksidaza indikatori) - ortofenildiamin quyiladi. Eritmaga antigen + antitelo - kon’yugat kompleksini aniqlash uchun 3 % li vodorod peroksid eritmasi qo‘shiladi. Planshetlarni yopib qorong‘i joyda uy haroratida 15-30 daqiqa qoldiriladi.
   
5. 
   Reaksiya ko‘rish orqali yoki spektrofotometrik usulda hisobga olinadi. Reaksiya ko‘rish orqali baholanganda kesishmalar soni bilan ifodalanadi:
   

Ikki va undan ortiq nishonga baholangan namuna musbat hisoblanadi. Maxsus antitelo bilan reaksiyada eng yuqori suyultirishda planshetaning nazoratli o‘yiqlari rangidan intensivligi yuqori bo‘lib, och sabzi rang bo‘yalsa (++), antigen titri hisoblanadi.
Reaksiya natijalarini spektrofotometrik hisobga olishda maxsuslik koeffisienti hisoblanadi. U o‘yiqchalardagi reaksiya mahsulotlarining nazoratli musbat antigen (OZ₁) optik zichligini (OZ) o‘yiqchalardagi substratli aralashmani nazoratli manfiy antigenli (OZ2) optik zichligi nisbatiga teng.
Maxsuslik koeffisienti 2, 1 dan kam bo‘lmasa reaksiya musbat, 2,1 dan kam bo‘lsa manfiy hisoblanadi. Antitelalarni aniqlash (yoki titrlash) uchun immunofermentli usulni qo‘yish texnikasi mikrob antigenini aniqlash va qiyoslash singari bajariladi, farqi shundaki, material sifatida tekshiriladigan qon zardobi ishlatiladi.


Nazorat savollari:

1. 
   Nyukaslga IFT qo‘yish texnikasi?
   
2. 
   Nyukaslga IFT qo‘yishda foydalaniladigan reagentlar to‘g‘risida tushuncha bering?
   
3. 
   Nyukaslga IFT qo‘yish texnikasi qaysi tur kasallikalardan farqlanadi?
   

178