1-ma`ruza mavzu: Biotexnologiyaning asosiy tushunchalari va ta’rifi

9-MA`RUZA 
Mavzu: Vektor molekulalar
.
 
Reja: 
1. Vektor tushunchasining mazmuni va uning xillari;
2. Vektor molekulalar yordamida genlar bankini yaratish. 
Tarkibida qo'shimcha irsiy axborotlar to’tuvchi rekombinant DNK molekulalarini 
hujayralarga kiritish va uning barqarorligini saqlash gen muhandisligining asosiy kalit 
operatsiyasi hisoblanadi. Buni amalga oshirish uchun vektor molekulalardan foydalaniladi. 
Agar DNK shundayligicha hujayraga kiritilsa, bakteriya hujayralaridagi fermentlar ularni 
nukleotidlarga parchalab tashlaydi. Ba'zi hollarda DNK hujayraga kirib o'rnashishi mumkin, 
lekin hujayraning bo'linishi jarayonida u nasldan-naslga berilmay yo'qolib ketadi. 
Rekombinant DNK hujayraning genetik apparatini tashkil qiluvchi qismiga aylanishi uchun 
u genomga birikishi (xromosomaga integratsiyasi) va shuning hisobiga replikatsiyalanishi 
yoki avtonom replikatsiyalanish xususiyatiga ega bo'lishi kerak. 
Begona DNKning replikatsiyasi, ekspressiyasi va transfer-matsiyasini (boshqa 
organizmga ko'chishini) ta'minlovchi DNK molekulasi vektor deb ataladi. Vektor hujayraga 
qo'shimcha irsiy axbo-rot kiritilishini amalga oshiradi. Vektor sifatida plazmidalar, 
bakteriofaglar, mobil elementlar va hayvonlarning viruslaridan foyda-lanish mumkin. 
Hozirgi vaqtda juda ko'p vektorlar yaratilgan bo'lib, ularni bir nechta tipga bo'lish mumkin: 

---

1. Klonlash uchun vektorlar. Bunday vektorlarga biriktirilgan DNK fragmentlarni 
replikatsiyalash orqali soni (amplifikatsiyasi) ni ko'paytirish uchun foydalaniladi. Bunday 
maqsadlar uchun bakteriya plazmidalari va faglar qo'llaniladi. Genomning katta o'lchamdagi 
fragmentlarini klonlash uchun esa bakteriya va achitqi xromosomalari asosida yaratilgan 
(ВАС va YAC) sun'iy vektorlaridan foydalaniladi. 
2. Ekspression vektorlar. Ulardan genlarning muayyan ketma-kctligini aniqlash va ularning 
oqsil mahsulotlarini tahlil qilish, muayyan oqsilni ishlab chiqishda foydalaniladi. 
Shuningdek, sutemizuvchilar, o'simliklar va achitqi hujayralarida genlar ekspressiyasini 
amalga oshiruvchi vektorlar ham yaratilgan. Eukariot organizmlar uchun ko'p lonli 
ekspression tizimlar yaratilgan ekspression vektorlar poliade-nillanish sayti va mazkur 
organizmda ishlash qobiliyatiga ega promotordan iborat ekspression kasseta tutadi. 
3. Transformatsiya uchun vektorlar. Bu vektorlardan retsipient gcnomiga begona DNK 
fragmentlarini kiritish uchun foydalaniladi. 
Bunday vektorlar odatda genomga integratsiyalanishiga yordam I beruvchi maxsus 
izchilliklar tutadi. Zamonaviy vektor tizimlar polifunksional bo'lib, bir nechta funksiyani 
bitta vektorga jamlaydi. Hirinchi tabiiy vektorlar bakteriyalardan ajratilgan bo'lib, ko'pchiligi 
tajriba maqsadidan kelib chiqqan holda (ekspression, klonlash uchun, transfoiTnatsiya uchun 
vektorlar) gen muhandisligi usullari yordamida qayta yaratilgan. 
Vektor molekulalarning tarkibida marker gen bo'lishi, bu gen hujayrada vektor ishtirok 
etayotgani haqida ma'lum qiluvchi fenotip berishi, ya'ni vektor selektiv irsiy belgiga ega 
bo'lishi kerak. Ko'pincha sclektiv belgi sifatida tabiatda keng tarqalgan antibiotikka 
chidamliiik genidan foydalaniladi. Bu genlarning oqsil mahsuloti-fermentlar antibiotiklarni 
modiflkatsiyalaydi va ularning ta'sirini inaktivlashtiradi (kuchsizlantiradi). Masalan, nptll 
geni kanamitsin antibiotigini inaktivlashtiruvchi neomitsin fosfotransferaza genini 
kodirlaydi. Hakteriya hujayrasi nptll geni ishtirokida kanamitsinga nisbatan chidamliiik hosil 
qiladi va shu antibiotik oziqa muhitlarida o'sib, klon va luijayralar koloniyasini hosil qiladi. 
Odatda tarkibida nptll geni bo`lmagan hujayralar bunday oziqa muhitlarida o'sa olmaydi va 
nobud bo'ladi. Demak, vektor konstruksiya tarkibida nptll genini tutishi vektor ishtirok 
etayotgan hujayralarni aniqlash va ularni tanlab olish imkonini beradi. 
Vektor molekulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o‘simliklarni xloroplast 
hamda mitoxondrial DNK lari o‘tashi mumkin.
Xo‘jalik ahamiyati qimmatli bo‘lgan genlarni ajratish uchun gen bibliotekasi tuziladi. 
Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi:
DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum 
sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo‘shliq DNK-ligaza 
fermenti yordamida o‘zaro biriktiriladi. Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga 
transformatsiya qilinadi. Xromosomal DNK da mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK 
o‘lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak.
Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. 
Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) 
nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK tRNK va pRNK dan ajratib olinadi. 
Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya 
qilinadi. Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA-dT qo‘sh zanjirli segment 
hosil bo‘ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga 
oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) 
vazifasini o‘taydi.

---

Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan 
tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o‘tagan iRNK molekulasi NaOH bilan 
parchalanadi natijada qisqa ikki zanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar 
bo‘lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi.
Hosil bo‘lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez 
qilishda praymer vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I fermenti yordamida kDNK ning 
ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNK ning bir zanjirli qismi SI-nukleaza 
fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. Shu 
yusinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi vektor molekulalariga ulangan holda 
klonlanadi.
Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib 
olish quyidagicha amalga oshiriladi - rekombinant plazmida denaturatsiya qilinadi 
(100
0
C haroratda 5 min., 0,2 N NaOH eritmasida 15 min.) bir zanjirli DNK molekulasi 
stabil qo‘zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtriga biriktiriladi. 
Olingan filtr [g
-32
P] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan 
gibridizatsiya qilinadi.
Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK 
molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari 
birikadi.
Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib nishonlangan iRNK 
molekulasi ajratib olinadi (elyusiya yordamida). Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz 
oqsil sintez qilish tizimida tekshirib kuriladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasining 
identifikatsiya qilish yo‘li bilan individual genlarni ajratib olish amalga oshiriladi.