I- Oksidatif patlamaya yönelik I- Oksidatif patlamaya yönelik Nötrofillerin fonksiyonun değerlendirilmesinde - En sık uygulanan test
- Süperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidir
Kronik granülomatöz hastalığın taramasında - Bu değerlendirme kullanılır
- ÇÜNKÜ;
- Bu hastalık fagositoz defekti sonucu gelişir
- ♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur
Dört test yöntemi kullanılır Dört test yöntemi kullanılır 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test) Testin prensibi - NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir
- Redükte olduğunda sarı renkten koyu mora dönüşür
- Nötrofiller;
- NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur
- NBT, nötrofil içine alınır
- Pyridine ile ekstrakte edilir
- 515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur
- Veya mikroskopta boyanarak görülebilir
Testin değerlendirilmesi - Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 oluşur
- Bunların redüktan etkisiyle
- NBT redükte olur (renk değişir)
- Öldürme işlemi olduğunu gösterir
Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan hastalıklarda - Kronik granülamatöz hastalık
- Chediak- Higashi sendromu
- Myeloperoksidaz yetmezliği olanlar
- Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olanlarda
- Akut lösemi
- Down sendromu
- Akut enfeksiyonu olanlarda
2)Sitokrom b ölçülmesi 2)Sitokrom b ölçülmesi ■ Fagositlerde bulunan; Oksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b’ nin İmmunolojik cihazlar Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir 3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi ■ Bu test H2O2 oluşumunu ölçer ■ Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin sonuç verir 4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar ■ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanır
Degranülasyon Degranülasyon - Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda
- Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdır
ELISA yöntemiyle - Lizozom içeriğinin
- Asid hidroloz
- Lizozim
- Laktoferrin
- Katyonik proteinlerin ölçümü yapılır
Mikrobisidal test Mikrobisidal test - Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alınır
- Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapılır
- Bir gece beklenir
- Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdır
DERİ TESTLERİ; DERİ TESTLERİ; Geç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerek - Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini
- Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanıyan bellekli T lenf varlığını saptar
- Test pozitifliği ancak klinik öyküyle anlamlıdır
- İntraselüler bakteri enfeksiyonlarında
- Tüberkülin deri testi olarak
- Old tüberkülin(OT)
- 1890 yılında R.Koch buldu
- PPD( purified protein derivide) uygulanır
- Saybert ve Glen 1941 yılında tanımladılar
- PPD-s olarak standardize edildi
- 1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir
- M.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında kullanılır
AYRICA; AYRICA; - Blastomisin (blastomikoz)
- Histoplazmin (histoplazmoz)
- Brucellin (bruselloz)
- Frei testi (LGV)
- Toksoplazmin (toksoplazmoz)
- Ekinokokkin(ekinokokkoz)
- Deri testleride kullanılır
Bunların dışında; - Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel maddelere karşı
- Dermatit tanısında panel antijenler kullanılır
- Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu
- Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin
- Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyle
- ♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir
PPD; PPD; Montoux deri içi uygulaması ile yapılır - 5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine
- 48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir
- Endurasyonu (Sertliği);
- ≥10 mm olan,
- ♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde
- ♣ Pozitifliği gösterir
- ≥ 15 mm olan
- ♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir
- 5-10 mm arası
- ♣ BCG aşılanmasına
- ♣ Atipiklerle çapraz reaksiyona
- ♣ Anerjiye bağlı olarak görülür
Pozitif deri testinin anlamlı olması için; - Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olması gerekir
Deri testinde teknik hatalar Deri testinde teknik hatalar ■ Uygunsuz antijen konsantrasyonu ■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılması ■ Subjektif değerlendirme ■ Test yerine dışsal müdahaleler ■ Booster olayı gelişebilir - Yaşla
- BCG aşılaması
- M.tuberculosis ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık
- Booster’ı artırır
İMMUN SİSTEMİN İMMUN SİSTEMİN - Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki
- Naif yapılarını
- Mutasyonel değişikliklerin
- Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir.
ÖRNEĞİN; - Antijen sunan hücrelerde(ASH) MHC I ve II moleküllerinin tayini
- Ig’lerin Fab kısmında variable(v)bölgesini,Fc kısmındaki CH2 gibi aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesi
- Fagositlerin sentezinde enzim ve sitokinlerin genetik mutasyonlarını ortaya koyan testler
- Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik mutasyonlarının ortaya konulmasında
Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri - Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirler
- Rutin tanı amaçlı konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir
ANCAK; - ANCAK;
- Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı birçok sendrom ve hastalığın,
- Örneğin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı
- Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder
- B hücre ve Ig izotiplerinde azalmaya nedeni olan B hücre tirozin kinaz genindeki mutasyonun belirlenmesi gibi
- Malign bazı hastalıkların;
- Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayini
- MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLAR
1)Hibridizasyon (birleşme) 2)Amplifikasyon (çoğaltma) başlıkları altında incelenir
Bir DNA molekülü Bir DNA molekülü - Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısı) özelliğindedir
- Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilen
- Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden birleşebilen
- İki sarmal zincire sahiptir
İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması - Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadır
Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır Bu zincirlerin varlığı PROB adı verilen işaretli DNA ve RNA parçasıyla gösterilmektedir PROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde - Flurokrom
- Enzim
- Kemülüminesan madde
- Radyoizotop kullanılmaktadır
PROBLAR - Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir
- 50 bp’den küçüktürler
Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir b)Katı faz hibridizasyonu I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi - Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır
Southern blot Southern blot - DNA’lar;
- Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kağıda aktarılır
- Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir
- DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)
- Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılır
- Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma
- Kronik myeloid lösemi
AYRICA; - AYRICA;
- B hücre lenfomalarında
- ♣ B hücre klonizitesinin incelenmesinde
- T hücre lenfomasında
- ♣ T hücre klonizitesinin incelenmesinde
- Nükleik asit boyutları konusunda yardımcı olur
Northern blot Northern blot - RNA’lar,
- Nitroseluloz kağıtlara aktarılır
- mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde
- 32p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır
Dot blot - DNA’lar,
- Nitroselüloz kağıtlarda
- DNA/DNA
- 32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır
II-MİKROARRAY II-MİKROARRAY Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanılır Klinik örnekten - Nükleik asidin pürifikasyonu
- Amplifikasyonu
- Hibridizasyonu
- Tespiti
- 25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır
Uygulama alanları - Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmaları
- Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler
- Gen up ve downregülasyonları
- Apoptozis mekanizmalarında
- Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesinde
Doku yada hücrelerdeki; Doku yada hücrelerdeki; - Nükleik asitleri saptar
DNA/DNA hibridlemesinde; - Biotin/AP işaretlemesi kullanılır
16S/23S r-RNA’ları hedefleyen Fluorokrom’la işaretleme olur - FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi)
FISH yöntemiyle; FISH yöntemiyle; Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak Veya kromozomal bozukluklarının saptanmasında kullanılır T hücre fonksiyonlarının belirlenmesinde
NAA yöntemleri - Hedef Amplifikasyon Sistemleri
- Prob Amplifikasyon Sistemleri
- Sinyal Amplifikasyon Sistemleri
adı altında incelenmektedir
İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA) İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA) - İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle
- Saptanabilecek düzeylere çıkarılmasıdır
PCR PCR - Klinik örnekte DNA aranıyorsa
- 4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
- Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlık)
- Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimi
- 94 ºC’de (denatürasyon)
- 54 ºC’de (bağlama)
- 72 ºC’de (Genişleme)
- ♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır
- Southern hibridizasyonla tanımlama yapılır
- Klinik örnekte RNA aranıyorsa
- RNA’nın elde edilmesinden sonra
- Revers-Transkriptaz uygulanarak
- cDNA’ya çevrilir
- Daha sonra cDNA amplifiye edilir
Değişik PCR tipleri - Değişik PCR tipleri
- Arbitrarily primer PCR(APP)
- Multiplex PCR(MP)
- Nested PCR(NP)
- RT-PCR(RTP)
- Kantitatif PCR(KP)
- Real time PCR(RTİP)
Eş zamanlı - Eş zamanlı
- Nükleik asit amplifikasyonu
- Amplifikasyon sırasında saptama yapılır
- Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green I)
- Kantitatif ve kalitatif sonuç
- Kısa sürede (2-3 saat) alınır
DNA Bağlayıcı Flouroforlar DNA Bağlayıcı Flouroforlar - Etidyum Bromid
- Syber Green
- Syber Gold
Problar - Lineer Oligo problar “HybProbes”
- 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq Man” **
- Molecular becon
Hedef molekülleri RNA’dır - Hedef molekülleri RNA’dır
- TAS( Transcription based Amp)
- TMA(Transcription mediated Amp)
- NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp)
- Northern blot ile tanımlama yapılır
Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab. - Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab.
- İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi incelemelerinde
- DNA yapısındaki mutasyonlar
- Gen tayini ve dizilimi saptaması
- Gen ve genetik polimorfizmi saptama
- Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanması
- Genetik manipülasyonun saptanması
B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi - Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanır
- Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Ligaz
C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi - Aslında prob hibridizasyon çoğaltma yöntemidir
- İki prob kullanılır
- Birinci prob hedef NA dizisini tanır
- Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır
- Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba bağlanır
- SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur
- Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİD oluşur
- RCA (Rolling Circle Amp)
- Tek nükleotid polymorfizm
- Allellik ayrımında kullanılır
MHC ve ÜRÜNLERİ MHC ve ÜRÜNLERİ - İnsan 6. kromozom kısa kolunda yer alırlar
- Üç gen bölgesine sahiptirler
- MHC Sınıf I gen bölgesi
- HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri
- MHC Sınıf II gen bölgesi
- HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri
- MHC Sınıf III gen bölgesi
HLA molekülleri - HLA molekülleri
- Glikoprotein yapısındadırlar
- Transmembranöz yapıda bulunurlar
- Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler
- HLA-I;
- En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere
- Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çoğunda,
- Eritrositler hariç
- HLA-II ise;
- Sınır olup APC (dendritik hücre, makrofaj)
- B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri,
- Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur
Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu Adli tıpta - Babalık tayininde
- Kimlik tanımlamasında
Bazı otoimmun hastalıkların tanısında - HLA-DR4 ile RA
- HLA-B 5 ile Behçet hastalığı
Üç grup altında yapılmaktadır Üç grup altında yapılmaktadır 1) MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLER 2) Antikor Temelli Yöntemler 3) Hücre Temelli Yöntemler
Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi, - Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi,
- Canlı hücre gerektirmemesi,
- Otomasyona uygun olması(serolojik ve hücresel yöntemlere göre),
- Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma
- HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesi
HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; - Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO) prob hibridizasyonu ile
- HLA-I ve II tayini
AVANTAJLARI; - Sekansa özgü oligonukleotitler kullanılarak yapılır
- Tüm lokusu içine alacak şekilde primer seçilir
- Strip, tüp, çip (mikroarray), boncuk (luminex teknoloji)
- Solid organ transp. da yeterli (böbrek, krc transp)
- Çok sayıda örnekle çalışılabilir
PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin - PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin
- SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi analizi yapılmaktadır
- KULLANIM ALANLARI;
- Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren örneklerde
- Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi, diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır.
SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE)) SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE)) Pyrosequencing Ekzonükleazla released fluorescence gibi
Immunolojide son yıllarda önem kazanan Immunolojide son yıllarda önem kazanan - Mikro RNA’lar(Mi RNA)
- Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA parçacıklarıdır.
A)Mikro-RNA bazlı çalışmalar B)Immunolojide bioinformatik gelişmeler - Immun genomik sistemlerin moleküler genetik bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdır
Mikro array ve genom dizilimi Mikro array ve genom dizilimi Deep sequencing Quantatif Real Time -PCR Mikrodizi veri analizi
Do'stlaringiz bilan baham: |