KLİNİK İmmunolojide hastaliğin tanisi iÇİN


Download 446 b.
bet11/11
Sana12.11.2017
Hajmi446 b.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11

I- Oksidatif patlamaya yönelik

  • I- Oksidatif patlamaya yönelik

  • Nötrofillerin fonksiyonun değerlendirilmesinde

    •  En sık uygulanan test
      •  Süperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidir
  • Kronik granülomatöz hastalığın taramasında

    •  Bu değerlendirme kullanılır
      •  ÇÜNKÜ;
        •  Bu hastalık fagositoz defekti sonucu gelişir
          • ♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur


Dört test yöntemi kullanılır

  • Dört test yöntemi kullanılır

  • 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test)

  • Testin prensibi

    •  NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir
      •  Redükte olduğunda sarı renkten koyu mora dönüşür
    •  Nötrofiller;
    •  NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur
      •  NBT, nötrofil içine alınır
      • Pyridine ile ekstrakte edilir
      •  515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur
        •  Veya mikroskopta boyanarak görülebilir


  • Testin değerlendirilmesi

    •  Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 oluşur
    •  Bunların redüktan etkisiyle
      •  NBT redükte olur (renk değişir)
        •  Öldürme işlemi olduğunu gösterir


  • Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan hastalıklarda

    •  Kronik granülamatöz hastalık
    •  Chediak- Higashi sendromu
    •  Myeloperoksidaz yetmezliği olanlar
    •  Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olanlarda
    •  Akut lösemi
    •  Down sendromu
    • Akut enfeksiyonu olanlarda
      •  NBT negatiftir


2)Sitokrom b ölçülmesi

  • 2)Sitokrom b ölçülmesi

  • ■ Fagositlerde bulunan;

  •  Oksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b’ nin

  •  İmmunolojik cihazlar

  •  Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir

  • 3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi

  • ■ Bu test H2O2 oluşumunu ölçer

  • ■ Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin sonuç verir

  • 4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar

  • ■ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanır



Degranülasyon

  • Degranülasyon

    •  Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda
      •  Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdır
  • ELISA yöntemiyle

    •  Lizozom içeriğinin
      •  Asid hidroloz
      •  Lizozim
      •  Laktoferrin
      •  Katyonik proteinlerin ölçümü yapılır


Mikrobisidal test

  • Mikrobisidal test

    •  Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alınır
    •  Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapılır
      •  Bir gece beklenir
      •  Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdır


DERİ TESTLERİ;

  • DERİ TESTLERİ;

  • Geç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerek

    •  Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini
    •  Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanıyan bellekli T lenf varlığını saptar
    •  Test pozitifliği ancak klinik öyküyle anlamlıdır
  • En sık uygulanan model

    •  İntraselüler bakteri enfeksiyonlarında
    •  Tüberkülin deri testi olarak
      •  Old tüberkülin(OT)
        •  1890 yılında R.Koch buldu
      •  PPD( purified protein derivide) uygulanır
      • M.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında kullanılır


AYRICA;

  • AYRICA;

    •  Blastomisin (blastomikoz)
    •  Histoplazmin (histoplazmoz)
    •  Brucellin (bruselloz)
    •  Frei testi (LGV)
    •  Toksoplazmin (toksoplazmoz)
    •  Ekinokokkin(ekinokokkoz)
      •  Deri testleride kullanılır
  • Bunların dışında;

    •  Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel maddelere karşı
      •  Dermatit tanısında panel antijenler kullanılır
    • Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu
      •  Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin
        •  Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyle
          • ♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir


PPD;

  • PPD;

  • Montoux deri içi uygulaması ile yapılır

    •  5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine
    •  48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir
      •  Endurasyonu (Sertliği);
        •  ≥10 mm olan,
          • ♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde
          • ♣ Pozitifliği gösterir
        •  ≥ 15 mm olan
          • ♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir
        •  5-10 mm arası
          • ♣ BCG aşılanmasına
          • ♣ Atipiklerle çapraz reaksiyona
          • ♣ Anerjiye bağlı olarak görülür
  • Pozitif deri testinin anlamlı olması için;

    •  Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olması gerekir




Deri testinde teknik hatalar

  • Deri testinde teknik hatalar

  • ■ Uygunsuz antijen konsantrasyonu

  • ■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılması

  • ■ Subjektif değerlendirme

  • ■ Test yerine dışsal müdahaleler

  • ■ Booster olayı gelişebilir

    •  Yaşla
    •  BCG aşılaması
    • M.tuberculosis ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık
    •  Booster’ı artırır


İMMUN SİSTEMİN

  • İMMUN SİSTEMİN

    • Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki
      • Naif yapılarını
      • Mutasyonel değişikliklerin
        • Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir.
  • ÖRNEĞİN;

    • Antijen sunan hücrelerde(ASH) MHC I ve II moleküllerinin tayini
    • Ig’lerin Fab kısmında variable(v)bölgesini,Fc kısmındaki CH2 gibi aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesi
    • Fagositlerin sentezinde enzim ve sitokinlerin genetik mutasyonlarını ortaya koyan testler
    • Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik mutasyonlarının ortaya konulmasında


Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri

  • Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri

    •  Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirler
      • Rutin tanı amaçlı konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir


ANCAK;

    • ANCAK;
      • Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı birçok sendrom ve hastalığın,
        • Örneğin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı
          • Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder
          • B hücre ve Ig izotiplerinde azalmaya nedeni olan B hücre tirozin kinaz genindeki mutasyonun belirlenmesi gibi
      • Malign bazı hastalıkların;
        • Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayini
      • MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLAR


  • 1)Hibridizasyon (birleşme)

  • 2)Amplifikasyon (çoğaltma)

  • başlıkları altında incelenir



Bir DNA molekülü

  • Bir DNA molekülü

    •  Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısı) özelliğindedir
    •  Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilen
    •  Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden birleşebilen
      •  İki sarmal zincire sahiptir
  • İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması

    •  Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadır


Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır

  • Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır

  • Bu zincirlerin varlığı PROB adı verilen işaretli DNA ve RNA parçasıyla gösterilmektedir

  • PROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde

    •  Flurokrom
    •  Enzim
    •  Kemülüminesan madde
    •  Radyoizotop kullanılmaktadır
  • PROBLAR

    •  Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir
    •  50 bp’den küçüktürler




  • a)Sıvı faz hibridizasyonu

  • Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir

    •  DNA/DNA
    •  DNA/RNA
  • b)Katı faz hibridizasyonu

  • I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi

        • Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır


Southern blot

  • Southern blot

    •  DNA’lar;
    • Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kağıda aktarılır
      •  Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir
    • DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)
    •  Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılır
      • Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma
      • Kronik myeloid lösemi
        •  Philadelphia kromozomu


 AYRICA;

      •  AYRICA;
        •  B hücre lenfomalarında
          • ♣ B hücre klonizitesinin incelenmesinde
        •  T hücre lenfomasında
          • ♣ T hücre klonizitesinin incelenmesinde
    • Nükleik asit boyutları konusunda yardımcı olur


Northern blot

  • Northern blot

    •  RNA’lar,
    •  Nitroseluloz kağıtlara aktarılır
    •  mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde
    •  32p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır
  • Dot blot

    • DNA’lar,
    •  Nitroselüloz kağıtlarda
    •  DNA/DNA
    •  32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır


II-MİKROARRAY

  • II-MİKROARRAY

  • Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanılır

  • Klinik örnekten

    •  Nükleik asidin pürifikasyonu
    •  Amplifikasyonu
    •  Hibridizasyonu
    •  Tespiti
      •  25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır
  • Uygulama alanları

    •  Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmaları
    • Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler
      • Gen up ve downregülasyonları
      • Apoptozis mekanizmalarında
    • Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesinde




Doku yada hücrelerdeki;

  • Doku yada hücrelerdeki;

    •  Nükleik asitleri saptar
  • DNA/DNA hibridlemesinde;

    •  Biotin/AP işaretlemesi kullanılır
  • 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen

  •  Fluorokrom’la işaretleme olur

    •  FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi)


FISH yöntemiyle;

  • FISH yöntemiyle;

    • Belirli genlerin;
  •  Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak

  •  Veya kromozomal bozukluklarının saptanmasında kullanılır

  • T hücre fonksiyonlarının belirlenmesinde



  • NAA yöntemleri

  • adı altında incelenmektedir



İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA)

  • İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA)

    •  İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle
      •  Saptanabilecek düzeylere çıkarılmasıdır


PCR

  • PCR

    •  Klinik örnekte DNA aranıyorsa
      •  4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
      •  Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlık)
      •  Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimi
        •  94 ºC’de (denatürasyon)
        •  54 ºC’de (bağlama)
        •  72 ºC’de (Genişleme)
          • ♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır
      •  Southern hibridizasyonla tanımlama yapılır
    •  Klinik örnekte RNA aranıyorsa




 Değişik PCR tipleri

    •  Değişik PCR tipleri
      •  Arbitrarily primer PCR(APP)
      •  Multiplex PCR(MP)
      •  Nested PCR(NP)
      •  RT-PCR(RTP)
      •  Kantitatif PCR(KP)
      •  Real time PCR(RTİP)


Eş zamanlı

    • Eş zamanlı
      • Nükleik asit amplifikasyonu
      • Amplifikasyon sırasında saptama yapılır
    • Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green I)
    • Kantitatif ve kalitatif sonuç
    • Kısa sürede (2-3 saat) alınır






DNA Bağlayıcı Flouroforlar

  • DNA Bağlayıcı Flouroforlar

    • Etidyum Bromid
    • Syber Green
    • Syber Gold
  • Problar

    • Lineer Oligo problar “HybProbes”
    • 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq Man” **
    • Molecular becon


Hedef molekülleri RNA’dır

    • Hedef molekülleri RNA’dır
      •  TAS( Transcription based Amp)
      •  TMA(Transcription mediated Amp)
      •  NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp)
        • Northern blot ile tanımlama yapılır


Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab.

      • Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab.
      •  İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi incelemelerinde
        •  DNA yapısındaki mutasyonlar
        •  Gen tayini ve dizilimi saptaması
        •  Gen ve genetik polimorfizmi saptama
        •  Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanması
        •  Genetik manipülasyonun saptanması


B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi

  • B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi

    • Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanır
    • Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Ligaz
          • LCR


C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi

  • C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi

    • Aslında prob hibridizasyon çoğaltma yöntemidir
    • İki prob kullanılır
    • Birinci prob hedef NA dizisini tanır
      • Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır
    • Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba bağlanır
      • SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur
      • Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİD oluşur
        • Örnek :
          •  b-DNA (dallanmış DNA)
    • RCA (Rolling Circle Amp)
      •  Tek nükleotid polymorfizm
      •  Allellik ayrımında kullanılır


MHC ve ÜRÜNLERİ

  • MHC ve ÜRÜNLERİ

    •  İnsan 6. kromozom kısa kolunda yer alırlar
    •  Üç gen bölgesine sahiptirler
      •  MHC Sınıf I gen bölgesi
        • HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri
      •  MHC Sınıf II gen bölgesi
        • HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri
      •  MHC Sınıf III gen bölgesi
        • Hsp, TNFα, C4A,C4B, C2


 HLA molekülleri

    •  HLA molekülleri
      •  Glikoprotein yapısındadırlar
      •  Transmembranöz yapıda bulunurlar
      •  Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler
      • HLA-I;
      • En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere
      •  Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çoğunda,
      •  Eritrositler hariç
      • HLA-II ise;
      •  Sınır olup APC (dendritik hücre, makrofaj)
      •  B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri,
      •  Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur


Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu

  • Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu

  • Adli tıpta

    •  Babalık tayininde
    •  Kimlik tanımlamasında
  • Bazı otoimmun hastalıkların tanısında

    • HLA-DR4 ile RA
    • HLA-B 5 ile Behçet hastalığı


Üç grup altında yapılmaktadır

  • Üç grup altında yapılmaktadır

  • 1) MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLER

  • 2) Antikor Temelli Yöntemler

  • 3) Hücre Temelli Yöntemler



Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi,

    • Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi,
    • Canlı hücre gerektirmemesi,
    • Otomasyona uygun olması(serolojik ve hücresel yöntemlere göre),
    • Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma
    • HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesi








HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE;

  • HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE;

    • Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO) prob hibridizasyonu ile
    • HLA-I ve II tayini
  • AVANTAJLARI;

    • Sekansa özgü oligonukleotitler kullanılarak yapılır
    • Tüm lokusu içine alacak şekilde primer seçilir
    • Strip, tüp, çip (mikroarray), boncuk (luminex teknoloji)
    • Solid organ transp. da yeterli (böbrek, krc transp)
    • Çok sayıda örnekle çalışılabilir






 PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin

    •  PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin
    • SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi analizi yapılmaktadır
    • KULLANIM ALANLARI;
        • Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren örneklerde
        • Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi, diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır.












SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE))

  • SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE))

  • Pyrosequencing

  • Ekzonükleazla released fluorescence gibi



Immunolojide son yıllarda önem kazanan

  • Immunolojide son yıllarda önem kazanan

    • Mikro RNA’lar(Mi RNA)
      • Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA parçacıklarıdır.
  • A)Mikro-RNA bazlı çalışmalar

      • Mikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidir
      • Mikro-RNA’nın klonlama tayinidir
      • Mikro-RNA ekspresyon ölçümüdür
  • B)Immunolojide bioinformatik gelişmeler

    • Immun genomik sistemlerin moleküler genetik bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdır


Mikro array ve genom dizilimi

  • Mikro array ve genom dizilimi

  • Deep sequencing

  • Quantatif Real Time -PCR

  • Mikrodizi veri analizi




Do'stlaringiz bilan baham:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11


Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2017
ma'muriyatiga murojaat qiling